陳 雪,胡迎春,鐘 武*

(1 西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院急診醫(yī)學(xué)教研室,瀘州 646000;2 西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科;*通訊作者,E-mail:zhongwu2876@sina.com)

膿毒癥是機(jī)體對感染的反應(yīng)失調(diào),其主要表現(xiàn)為炎癥的爆發(fā)、機(jī)體的免疫抑制,以及最后的器官功能障礙,該疾病的死亡率達(dá)30%左右[1,2]。目前關(guān)于該疾病的機(jī)制研究非常多,而內(nèi)毒素耐受就是其中一個至關(guān)重要的分支。從膿毒癥患者血液中分離出來的單核巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出了對于炎性刺激的一種低反應(yīng)狀態(tài),其主要表現(xiàn)為相關(guān)炎癥因子的產(chǎn)生減少和HLA-DR的表達(dá)減少,這種現(xiàn)象就被稱之為內(nèi)毒素耐受[3]。內(nèi)毒素耐受最開始被定義為在受到低劑量內(nèi)毒素的預(yù)先刺激之后,對于隨之而來的大劑量的內(nèi)毒素刺激的一種耐受的狀態(tài)[4],這一現(xiàn)象是在1947被Besson等首先報道的,他們利用在動物體內(nèi)反復(fù)注射細(xì)菌內(nèi)致熱源的方法,觀察到了實(shí)驗(yàn)動物對致熱源發(fā)生的發(fā)熱反應(yīng)逐漸減低的現(xiàn)象。目前關(guān)于內(nèi)毒素耐受現(xiàn)象的機(jī)制研究主要停留在TLR4信號通路相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)[6-8]、免疫細(xì)胞的凋亡[9,10]、miRNA調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[11-13]、免疫細(xì)胞的重編程[14,15]等方面。但這些研究并不能對內(nèi)毒素耐受的發(fā)生、發(fā)展做出全面的解釋。

在大數(shù)據(jù)發(fā)展的今天,生物信息學(xué)技術(shù)在醫(yī)療研究中的運(yùn)用越來越廣泛,我們利用基因芯片數(shù)據(jù)庫,找到膿毒癥與內(nèi)毒素耐受相關(guān)的數(shù)據(jù)信息,并通過相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)平臺及軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,尋找各種分散模塊之間的內(nèi)在聯(lián)系,讓我們對內(nèi)毒素耐受相關(guān)的核心基因及膿毒癥產(chǎn)生和發(fā)展的內(nèi)在機(jī)制有了更加清晰的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)材料

以“LPS TOLERANCE”為檢索關(guān)鍵詞在GEO數(shù)據(jù)庫檢索獲得芯片數(shù)據(jù)GSE8621,并抽取了其中內(nèi)毒素耐受及膿毒癥相關(guān)的樣本各3個進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。該芯片的實(shí)驗(yàn)組是使用了低劑量LPS(脂多糖)預(yù)刺激的raw264.7細(xì)胞,隨后實(shí)驗(yàn)組和對照組都使用了高劑量的LPS刺激以形成膿毒癥模型[16]。

1.2 差異基因篩選

將數(shù)據(jù)提交到GCBI(https://www.gcbi.com.cn)平臺,通過該平臺對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理,隨后進(jìn)行樣本分組,分為了膿毒癥組和耐受組,并設(shè)置篩選差異表達(dá)基因參數(shù):P<0.05,FC>1.5。

1.3 GO分析及KEGG分析

GO(http://www.geneontology.org/)是用于標(biāo)準(zhǔn)化基因及其產(chǎn)物而建立的數(shù)據(jù)庫,將篩選出的差異表達(dá)基因提交于該網(wǎng)站,采用Goatools軟件對篩選出的差異基因集進(jìn)行GO富集分析,使用Fisher精確檢驗(yàn),并采用Bonferroni方法對P值進(jìn)行校正,P<0.05時,可認(rèn)為該GO功能存在顯著富集情況,基于GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能分類,以確定兩樣本之間的差異基因主要參與了哪些生物學(xué)進(jìn)程,并找到較為關(guān)鍵的幾個生物學(xué)功能。KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)能系統(tǒng)地分析基因功能并將基因組信息與功能信息相聯(lián)系,利用此數(shù)據(jù)庫,可將基因集中的基因按照參與的通路或行使的功能分類,用到的軟件是IPA,同樣使用了Fisher精確檢驗(yàn)并使用BH(Benjamini and Hochberg)法對P值進(jìn)行校正,使P<0.05。將差異基因提交到KEGG數(shù)據(jù)庫,找到本實(shí)驗(yàn)篩選出的差異基因主要集中于哪些信號通路,從而找到與內(nèi)毒素耐受關(guān)系最為密切的信號通路。

1.4 共表達(dá)分析

是基于基因表達(dá)的相似程度而進(jìn)行的模塊分類,使用R軟件包進(jìn)行WGCNA(權(quán)重共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析,https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA/),生成純文本文件,再利用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,從而找到各差異基因表達(dá)值的相關(guān)性,直觀地發(fā)現(xiàn)處于核心部位的基因,為進(jìn)一步的研究提供依據(jù)[17]。

1.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

蛋白質(zhì)作為細(xì)胞分子生物系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)原件,蛋白質(zhì)之間的相互作用,是細(xì)胞發(fā)揮功能的關(guān)鍵,將芯片數(shù)據(jù)提交到STRING(https://string-db.org)在線平臺以構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),該平臺是將現(xiàn)存研究中的生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)、高通量表達(dá)數(shù)據(jù)及其他分子狀態(tài)整合為一個統(tǒng)一框架[18],獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系后,利用Python下的networkX對感興趣基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化,以幫助了解差異基因之間的相互關(guān)系和蛋白質(zhì)的生物功能,對疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制進(jìn)行更加深度的剖析[19]。

2 結(jié)果

2.1 差異基因的篩選結(jié)果

通過對GSE8621的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,從膿毒癥與內(nèi)毒素耐受這兩個分組中共篩選出了2 584個差異基因(P<0.05),與膿毒癥組相比,內(nèi)毒素耐受組中有1 618個下調(diào)基因、966個上調(diào)基因(見圖1)。由差異基因聚類分析可知,本研究篩選出的差異基因可以明顯地區(qū)分出膿毒癥組與內(nèi)毒素耐受組(見圖1)。

圖中縱列代表每個樣本芯片,橫坐標(biāo)代表每個基因的表達(dá)值,紅色代表該基因在樣本中是上調(diào)的,綠色代表該基因在樣本中是下調(diào)的,顏色深淺與基因的上下調(diào)程度呈正比圖1 差異表達(dá)基因的聚類分析Figure 1 Cluster analysis of differentially expressed genes

2.2 差異基因GO富集分析結(jié)果

對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析,結(jié)果表明差異表達(dá)基因主要參與了細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、細(xì)胞的凋亡以及蛋白質(zhì)的磷酸化。其中排在前10位的生物學(xué)功能分別是:①細(xì)胞凋亡;②磷酸化;③轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)節(jié)(DNA依賴性);④凋亡過程的負(fù)調(diào)節(jié);⑤轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)(DNA依賴性);⑥蛋白質(zhì)磷酸化;⑦RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)節(jié);⑧RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié);⑨轉(zhuǎn)錄;⑩DNA依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(見圖2)。

2.3 差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析

篩選出的2 584個差異基因富集于160條信號通路網(wǎng)絡(luò)中,其中最為突出的有:代謝相關(guān)通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、腫瘤相關(guān)信號通路、Jak-STAT信號通路、NF-kB信號通路、TLRs信號通路(見圖3)。

2.4 共表達(dá)分析

以差異基因表達(dá)譜的相似性為基本標(biāo)準(zhǔn),構(gòu)建了基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),并找到位于網(wǎng)絡(luò)樞紐位置的基因作為其核心基因。可以看出基因:Pik3r2、Nfkb1、Plcg2、Gnai3、Rac3、Src均位于網(wǎng)絡(luò)的核心位置,其有望成為內(nèi)毒素耐受的關(guān)鍵基因(見圖4)。

2.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)模塊

將差異基因上傳至STRING在線網(wǎng)絡(luò)平臺,用以分析差異基因所表達(dá)的蛋白之間的相互作用,并構(gòu)建出蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)模塊,基因Src、Rnd1、Edn1、Socs3、Il10等表達(dá)的蛋白處于網(wǎng)絡(luò)模塊的核心位置(見圖5)。

圖2 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析Figure 2 GO functional enrichment analysis of differential expression genes

圓點(diǎn)表示基因,連線越多面積越大,紅色表示上調(diào),藍(lán)色表示下調(diào)圖4 差異基因的共表達(dá)分析Figure 4 Co-expression analysis of differential genes

每個節(jié)點(diǎn)代表相應(yīng)的蛋白,節(jié)點(diǎn)間的連線代表蛋白間存在相互作用圖5 差異蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Figure 5 Differential protein interaction network diagram

3 討論

膿毒癥最初的表現(xiàn)多為炎癥爆發(fā)、失控,緊接著機(jī)體就處于一種免疫抑制狀態(tài),對于進(jìn)一步的刺激呈現(xiàn)出反應(yīng)低下的狀態(tài),這也是重癥監(jiān)護(hù)室中膿毒癥患者死亡率一直居高不下的原因之一,迅速采集這些患者的血液樣本,分析發(fā)現(xiàn)包括CD4+和CD8+T細(xì)胞,B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞處于一種凋亡誘導(dǎo)的狀態(tài),其數(shù)量也明顯低于正常水平[20]。在內(nèi)毒素耐受的巨噬細(xì)胞中存在著基因轉(zhuǎn)錄混合變異的現(xiàn)象,這種現(xiàn)象被稱之為巨噬細(xì)胞重編程[21],這種重編程還與巨噬細(xì)胞極化現(xiàn)象有著密切的關(guān)系[22]。GO功能注釋分析結(jié)果表明,我們篩選差異基因參與的生物進(jìn)程主要與轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、細(xì)胞的凋亡以及蛋白質(zhì)的磷酸化相關(guān)。

近年來關(guān)于TLR家族與膿毒癥之間的關(guān)系,主要集中在膿毒癥免疫抑制這一方面,而產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受的機(jī)體也表現(xiàn)出一種對炎癥刺激低反應(yīng)的免疫抑制狀態(tài),TLRs是機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子,TLRs家族中的成員在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[23],同時TLR4在內(nèi)毒素耐受中呈現(xiàn)出活化狀態(tài)并且與其下游的MAPK通路產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng),從而抑制了MAPK信號通路與NF-κB信號通路,TLR4途徑的激活還可以改善組織器官的炎癥損傷[24-27]。LPS可激活PI3K/AKT通路,該通路調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá),同時它還通過抑制TLR4信號通路來參與內(nèi)毒素耐受[28]。

在差異基因共表達(dá)分析網(wǎng)絡(luò)中,NF-κB1處于網(wǎng)絡(luò)的樞紐位點(diǎn),且先前的研究也證實(shí)了NF-κB的P50(NF-κB1)亞基的表達(dá)水平與膿毒癥相關(guān)炎癥因子TNF-α的產(chǎn)生呈負(fù)相關(guān),并在內(nèi)毒素耐受的產(chǎn)生過程中起到了一定的作用[29]。Src家族激酶參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)的許多方面[30],Src家族激酶Lyn能夠負(fù)性調(diào)節(jié)TLR信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),在內(nèi)毒素耐受狀態(tài)下,Src的磷酸受到了抑制[31],同時在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)模塊中Src基因也是處于網(wǎng)絡(luò)的核心位置,與之關(guān)聯(lián)的基因數(shù)量最多,盡管現(xiàn)有的研究從不同的方面揭示了該基因與內(nèi)毒素耐受及膿毒癥之間的關(guān)系,但是并未有統(tǒng)一的意見出現(xiàn),因此需要我們進(jìn)一步的研究。

Socs3的表達(dá)依賴于JAK/STAT途徑的調(diào)控,Noh等[32]利用IDO+/+與IDO-/-小鼠模型驗(yàn)證了血小板活化因子(PAF)可以通過調(diào)節(jié)Socs3的IDO-和JAK/STAT依賴途徑來介導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受,Il10的表達(dá)也與之相關(guān),這與我們的KEGG通路分析及STRING蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果是一致的。

總之通過生物進(jìn)程、功能通路、基因共表達(dá)、蛋白質(zhì)相互作用等一系列的數(shù)據(jù)分析方式,我們找到了許多與內(nèi)毒素耐受的發(fā)生機(jī)制關(guān)系密切的生物因子,部分因子已經(jīng)被證實(shí)與內(nèi)毒素耐受的發(fā)生機(jī)制相關(guān),還有部分生物因子并未出現(xiàn)在內(nèi)毒素耐受相關(guān)的文獻(xiàn)報道中,這或許可以為我們探究內(nèi)毒素耐受的內(nèi)在機(jī)制及膿毒癥的預(yù)防和治療提供新的方向。