侯 磊,趙永麗,安改麗,何 莉,陳 鑫

(1 陜西省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,西安 710068;2 陜西省康復(fù)醫(yī)院手術(shù)室;3 陜西省人民醫(yī)院腫瘤放療科;*通訊作者,E-mail:s.ob@qq.com)

多肽具有分子量小、免疫原性低、易于修飾及不易耐藥等特點(diǎn),因此,被越來(lái)越多地應(yīng)用于腫瘤診斷與治療中,其中大部分多肽衍生于某些特異性抗體片段或配體分子,主要作為靶向載體攜帶抗腫瘤藥物定位于腫瘤組織發(fā)揮作用。如經(jīng)典的RGD模序,能夠特異性識(shí)別在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的整合素αvβ3,將抗腫瘤藥物或顯影劑特異性轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤組織發(fā)揮靶向性抗腫瘤作用或腫瘤特異性成像[1-4]。近年來(lái)還有一種被稱為NGR(Asn-Gly-Arg,NGR)模序的小分子多肽被發(fā)現(xiàn)[5-7],它能夠特異識(shí)別在腫瘤新生血管表達(dá)的氨基肽酶N(CD13),并能在脫酰胺作用后生成isoDGR,一種相較于RGD模序?qū)Ζ羦β3具有更高親和力的小分子多肽[8,9]。此外,研究還表明,環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以增加小分子多肽對(duì)靶點(diǎn)的親和力,提高載體腫瘤靶向轉(zhuǎn)運(yùn)的效率。目前除了具有載體作用的多肽外,還有另一類小分子多肽,并不具備靶向載體功能,而是擁有殺傷腫瘤細(xì)胞的能力,通常通過(guò)自身二級(jí)結(jié)構(gòu)和靶細(xì)胞膜的理化性質(zhì)來(lái)殺死目標(biāo)細(xì)胞。如抗菌肽(AMP),能夠通過(guò)破壞帶負(fù)電的腫瘤細(xì)胞膜誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與壞死。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

采用L-15不完全培養(yǎng)液(含10%血清)在5%CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞。每2-3 d傳代1次，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞存活試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,接種于96孔板,待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期時(shí),分別換用含不同濃度CDAK(20,40,100,200,400 μg/ml)、CNAK(20,40,100,200,400 μg/ml)及CRLK(200 μg/ml)無(wú)血清培養(yǎng)液100 μl,孵育20 h,設(shè)4個(gè)復(fù)孔,各孔中加入5 mg/ml MTT 20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄掉培養(yǎng)液,加入100 μl DMSO,37 ℃振蕩15 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔A490值,取均值。使用軟件Graphpad Prism 5.0計(jì)算細(xì)胞半抑制濃度(IC50)。

1.4 熒光顯微鏡觀察多肽識(shí)別

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,加入不同多肽(CDAK,CNAK,CRLK;10 mg/ml;氨基酸C端K殘基用于連接標(biāo)記熒光羅丹明B)孵育12 h,PBS緩沖液沖洗3次,于熒光顯微鏡下觀察,550 nm激發(fā)波長(zhǎng),620 nm發(fā)射波長(zhǎng),曝光400 ms。細(xì)胞核染色采用DAPI染色,用PBS稀釋,最終濃度100 ng/ml。加入150 μl至每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中,孵育15 min,熒光顯微鏡下觀察。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)多肽結(jié)合

將細(xì)胞接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h用CDAK,CNAK和CRLK處理細(xì)胞(10 mg/ml;氨基酸C端K殘基用于連接標(biāo)記熒光羅丹明B)12 h。孵育結(jié)束,通過(guò)胰蛋白酶消化細(xì)胞,PBS緩沖液洗滌3次,流式細(xì)胞儀分析熒光強(qiáng)度。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡

用CDAK、CNAK和CRLK處理細(xì)胞(200 mg/ml)24 h,胰酶消化細(xì)胞,加入400 μl 1×Binding Buffer和5 μl AnnexinⅤ-FITC室溫避光15 min,10 μl PI冰浴避光5 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.7 Western-blot檢測(cè)Caspase-3蛋白表達(dá)

細(xì)胞處理同凋亡檢測(cè),蛋白裂解液提取蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。相同劑量蛋白樣品使用SDS-PAGE凝膠分離,目的條帶用PVDF膜轉(zhuǎn)膜,含5%脫脂牛奶的TBST封閉2 h,加一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜15 min 3次，加入相應(yīng)二抗,室溫孵育1 h,TBST洗膜15 min 3次,ECL發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá)狀況。使用Image-ProPlus軟件分析灰度值。以Caspase-3條帶與內(nèi)參β-actin灰度值比值代表Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 多肽對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制

使用MTT檢測(cè)CDAK、CNAK對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞毒性,并計(jì)算IC50值。CDAK、CNAK對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞存在生長(zhǎng)抑制作用,且呈現(xiàn)劑量依賴性(見(jiàn)圖1)。24 h的IC50分別為227 μg/ml(CDAK)、210 μg/ml(CNAK)。結(jié)果表明,兩種多肽均能抑制MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng),相對(duì)CDAK,CNAK細(xì)胞毒性更大,但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 不同濃度CDAK與CNAK作用24 h對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)抑制Figure 1 Effect of CDAK and CNAK on the proliferation of MDA-MB-231 cells after treatment for 24 h

2.2 多肽對(duì)細(xì)胞識(shí)別與結(jié)合能力

為了觀察多肽靶向識(shí)別能力與在細(xì)胞內(nèi)分布情況,我們合成了一部分?jǐn)y帶羅丹明B的多肽。首先通過(guò)熒光顯微鏡觀察,結(jié)果顯示,CDAK與CNAK均能進(jìn)入MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi),但HFF細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有觀察到熒光(見(jiàn)圖2A)。接著通過(guò)DAPI核染色觀察多肽在細(xì)胞內(nèi)分布,發(fā)現(xiàn)多肽能夠進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),在胞漿及核內(nèi)均有分布(見(jiàn)圖2B)。最后我們?cè)贛DA-MB-231細(xì)胞上使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種多肽細(xì)胞結(jié)合能力。CRLK、CDAK、CNAK熒光強(qiáng)度分別為4.3 ±0.61 ，22 ±2.16，28 ±2.98,CDAK與CNAK熒光強(qiáng)度較CRLK明顯增多(P<0.05),CNAK較CDAK熒光強(qiáng)度明顯增多(P<0.05)。結(jié)果表明CNAK相較于CDAK對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞具有更高結(jié)合能力(見(jiàn)圖2C),其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 多肽對(duì)細(xì)胞凋亡影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,CDAK、CNAK、CRLK作用細(xì)胞24 h,MDA-MB-231凋亡率分別為(23.56 ±2.16)%,(25.33 ±2.77)%,(4.3 ±0.5)%(見(jiàn)圖3)。結(jié)果表明,相對(duì)于空白對(duì)照,CDAK與CNAK均能誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡(P<0.05),而CRLK對(duì)細(xì)胞凋亡并無(wú)顯著影響(P>0.05)。CNAK相較于CDAK,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示CNAK與CDAK誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡能力無(wú)明顯差異。

2.4 Western-blot檢測(cè)多肽對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Caspase-3蛋白影響

空白對(duì)照、CRLK、CDAK、CNAK中Caspase-3相對(duì)蛋白表達(dá)量分別為0.96 ±0.09，0.87 ±0.09，1.6 ±0.14，1.87 ±0.21(見(jiàn)圖4)。相較于空白對(duì)照組與CRLK組，CNAK和CDAK組Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但CNAK組與CDAK組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CRLK組與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明CDAK與CNAK均能誘導(dǎo)Caspase-3蛋白表達(dá)，但誘導(dǎo)Caspase-3蛋白表達(dá)能力無(wú)顯著差異。

圖2 CDAK與CNAK對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞識(shí)別與結(jié)合能力Figure 2 Affinity of CDAK and CNAK against MDA-MB-231 cells

與空白對(duì)照組比較,* P<0.05;與CRLK組比較,#P<0.05圖3 CDAK與CNAK作用24 h對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡影響Figure 3 Effect of CDAK and CNAK on the apoptosis of MDA-MB-231 cells for 24 h

與空白對(duì)照組比較,* P<0.05;與CRLK組比較,#P<0.05圖4 Western blot檢測(cè)CDAK與CNAK作用24 h對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中Caspase-3表達(dá)影響Figure 4 Effect of CDAK and CNAK on the expression of Caspase-3 in MDA-MB-231 cells for 24 h by Western blot

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