胡 家,楊 穎,李 蕾,殷愛(ài)紅,李慎濤*

(1 首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室,北京 100069;*通訊作者,E-mail:lishentao@sina.com)

近幾十年來(lái),基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)有了長(zhǎng)足發(fā)展[1,2]。樣品制備是其中的一個(gè)重要環(huán)節(jié),也是蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的一個(gè)技術(shù)瓶頸[3,4]。在細(xì)胞水平上進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究時(shí),通常包括一些必不可少的步驟,如收集細(xì)胞樣品、細(xì)胞裂解、蛋白抽提、蛋白純化、蛋白定量、蛋白酶切和蛋白樣品脫鹽等[2-9]。在細(xì)胞總蛋白提取過(guò)程中,通常需要加入去污劑[2],但在進(jìn)行翻譯后修飾研究時(shí),去污劑會(huì)對(duì)富集修飾化多肽產(chǎn)生影響,也會(huì)對(duì)酶切效率產(chǎn)生影響,并且在質(zhì)譜測(cè)試過(guò)程中極易離子化,在質(zhì)譜圖上顯示出比多肽離子信號(hào)強(qiáng)度高得多的信號(hào),從而對(duì)實(shí)際樣品測(cè)試產(chǎn)生不良影響[3-7]。為了避免去污劑的影響,通常會(huì)在酶切之前加入很多去除去污劑的步驟,這不但費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且會(huì)導(dǎo)致一些疏水蛋白丟失[6,7]。

本研究比較了三種無(wú)去污劑的細(xì)胞總蛋白酶切樣品制備方法,觀察質(zhì)譜對(duì)細(xì)胞總蛋白的鑒定情況。第一種方法:以聚丙烯酰胺凝膠制成的干膠粒作為介質(zhì),讓干膠粒吸入收集的完整細(xì)胞樣品,再進(jìn)行膠內(nèi)酶切,稱(chēng)為“細(xì)胞吸入膠內(nèi)酶切法”[3];第二種方法:同樣以干膠粒作為介質(zhì),將細(xì)胞的蛋白裂解液吸入干膠粒中,再進(jìn)行蛋白膠內(nèi)酶切,稱(chēng)為“蛋白吸入膠內(nèi)酶切法”[3,7,10];第三種方法:以超濾膜作為輔助物的溶液酶切方法,稱(chēng)為“超濾管輔助溶液酶切法”(filter-aided sample preparation,FASP)[5]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

293T細(xì)胞系,由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑和儀器

尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、TEMED、二硫蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT)、碘乙酰胺(Iodoacetamide,IAA)和碳酸氫銨為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;10 kD超濾濃縮管為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品;胰蛋白酶為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品;質(zhì)譜級(jí)純水、乙腈、甲醇、甲酸和三氟乙酸為美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品。NanoDrop微量分光光度計(jì)和SpeedVac真空干燥機(jī)為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品;Easy-Nano LC液相色譜儀和Triple TOF6600質(zhì)譜儀為美國(guó)Sciex公司產(chǎn)品。

1.3 干膠粒制備

在1.5 ml EP管中依次加入25 mmol/L碳酸氫銨30 μl、丙烯酰胺/甲叉(30%,29 ∶1,W/V)16.7 μl、過(guò)硫酸銨(10%)2.5 μl和TEMED 0. 05 μl,輕輕混勻。待凝膠聚合之后,將其切成小塊,用50%乙腈/50 mmol/L碳酸氫銨洗滌2次,用乙腈脫水2次。然后將膠粒放入真空干燥機(jī)中旋干,-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 293T細(xì)胞蛋白提取

按參考文獻(xiàn)[11-13]的方法,在約2.6×106個(gè)細(xì)胞沉淀中加入5倍體積預(yù)冷裂解液[含20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、8 mol/L尿素、20 mmol/L DTT和蛋白酶抑制劑],渦旋均勻,置于冰上裂解細(xì)胞2 h,期間在冰浴上超聲破碎細(xì)胞(功率2 W、超聲時(shí)間2 s、間歇2 s、20個(gè)循環(huán)),至細(xì)胞蛋白裂解液澄清。再將細(xì)胞蛋白裂解液于4 ℃、40 000g離心1 h,取離心上清、分裝,一部分用于蛋白吸入膠內(nèi)酶切法,余下用于后述的超濾管輔助溶液酶切法。

1.5 細(xì)胞吸入膠內(nèi)酶切法

收集約105個(gè)細(xì)胞沉淀,重懸于30 μl預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑的樣品緩沖液(25 mmol/L碳酸氫銨,pH 8.0)中,混勻后加入干膠粒中,靜置10 min,讓干膠粒充分吸收樣品,將樣品分別置于-80 ℃冰箱和37 ℃水浴中劇烈凍融2次。分別加入50 μl 10 mmol/L DTT和30 mmol/L IAA,對(duì)樣品進(jìn)行還原和烷基化,然后用50%乙腈/50 mmol/L碳酸氫銨洗滌2次,用100%乙腈脫水兩次,將膠粒放入真空干燥機(jī)中旋干。將膠粒置于冰上,加入50 μl 0.01 μg/μl胰蛋白酶(溶于25 mmol/L碳酸氫銨中)。酶切過(guò)夜后,對(duì)多肽產(chǎn)物進(jìn)行兩次抽提,第1次用5% TFA溶液加入膠粒樣品中,37 ℃孵育30 min,再轉(zhuǎn)移至超聲水浴中超聲5 min,將樣品溶液移至一新管中;第2次用2.5%三氟乙酸/50%乙腈溶液加入膠粒樣品中,37 ℃孵育30 min,再轉(zhuǎn)移至超聲水浴中超聲5 min,取出樣品溶液,并與第1次取出的樣品混合,放入真空干燥機(jī)中旋干,凍存于-20 ℃。

1.6 蛋白吸入膠內(nèi)酶切方法

取30 μl 293T細(xì)胞的蛋白裂解液加入干膠粒中,待膠粒完全吸收蛋白樣品后,后續(xù)的處理過(guò)程同上述細(xì)胞吸入膠內(nèi)酶切法。

1.7 超濾管輔助溶液酶切法

按參考文獻(xiàn)[5]的方法,向30 μl 293T細(xì)胞蛋白裂解液中加入DTT至終濃度10 mmol/L,37 ℃孵育2.5 h,使樣品中蛋白的二硫鍵處于打開(kāi)狀態(tài),恢復(fù)至室溫,加入碘乙酰胺至終濃度50 mmol/L,避光放置40 min,對(duì)打開(kāi)的二硫鍵進(jìn)行烷基化保護(hù)。將樣品轉(zhuǎn)移至10 kD超濾濃縮管中,10 000g、20 ℃離心30 min,在超濾管內(nèi)管中加入200 μl含20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)及8 mol/L尿素的溶液,10 000g、20 ℃離心30 min,重復(fù)本步驟2-3次。在超濾管內(nèi)管中加入200 μl 50 mmol/L碳酸氫銨,10 000g、4 ℃離心30 min,重復(fù)本步驟2-3次。換1個(gè)新的超濾管套管,在內(nèi)管中加入150 μl 50 mmol/L碳酸氫銨,按照總蛋白和胰蛋白酶50 ∶1的比例(體積比)加入酶液,37 ℃孵育16 h。10 000g、4 ℃離心30 min,加入100 μl 50 mmol/L碳酸氫銨,10 000g、4 ℃離心30 min,該步驟重復(fù)3次,收集多肽樣品。向樣品中加入終濃度1%的甲酸,凍干樣品。

1.8 質(zhì)譜檢測(cè)

將酶切樣品用A相溶液[含0.1%甲酸(W/W)和2%乙腈(W/W)]重溶后,經(jīng)NanoDrop進(jìn)行蛋白定量,18 000g離心10 min,取4 μl上清上樣,進(jìn)行納升級(jí)液相與Triple TOF6600質(zhì)譜聯(lián)用分析。色譜柱:C18除鹽柱(3 μm,120 ?,350 μm×0.5 mm)、C18分析柱(3 μm,120 ?,75 μm×150 mm),系統(tǒng)柱壓小于6 000 Psi;流速0.6 μl/min;90 min分析梯度:0 min,5% B相溶液[含0.1%甲酸(W/W)和98%乙腈(W/W)];0-0.1 min,5% B相溶液;0.1-55 min,5%-22% B相溶液;55-70 min,22%-30% B相溶液;70-75 min,30%-45% B相溶液;75-76 min,45%-90% B相溶液;76-81 min,90% B相溶液;81-82 min,90%-5% B相溶液;82-90 min,5% B相溶液。質(zhì)譜條件:ESI源、正離子掃描模式、噴霧電壓2.3 kV、離子源溫度150 ℃。蛋白鑒定質(zhì)譜掃描模式:一級(jí)全掃描,范圍m/z350-1 500;二級(jí)挑選40個(gè)豐度高的前體離子進(jìn)行CID動(dòng)態(tài)碎裂;掃描范圍m/z100-1 500,動(dòng)態(tài)排除掃描,動(dòng)態(tài)排除時(shí)間15 s。

1.9 數(shù)據(jù)處理

用SCIEX提供的搜索引擎“Protein Pilot Software 5.0”對(duì)液質(zhì)聯(lián)用數(shù)據(jù)進(jìn)行搜庫(kù),使用Uniprot Homo sapiens(Human)數(shù)據(jù)庫(kù)(更新于2016年8月),設(shè)置一級(jí)質(zhì)量偏差10 ppm、二級(jí)質(zhì)量偏差20 ppm,胰蛋白酶酶切,半胱氨酸碘乙酰胺烷基化。獲得置信度較高(假陽(yáng)性率,FDR<1%)的鑒定結(jié)果。通過(guò)韋恩圖(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對(duì)三種方法所得蛋白種類(lèi)進(jìn)行分析。采用Uniprot網(wǎng)站(https://www.uniprot.org/uploadlists/)對(duì)所鑒定到的蛋白匹配到UniProtKB IDs,對(duì)匹配上的蛋白進(jìn)行Gene Ontology分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞總蛋白酶切后多肽樣品液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)結(jié)果

將三種方法所得細(xì)胞總蛋白酶切多肽樣品分別上樣,液質(zhì)聯(lián)用所用方法一致,液相所得色譜圖見(jiàn)圖1。三種酶切方法所得樣品蛋白鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

從色譜圖可看出,對(duì)于細(xì)胞吸入膠內(nèi)酶切法和超濾管輔助溶液酶切法制備的樣品,液相梯度設(shè)置合理,多肽樣品在整個(gè)梯度時(shí)間內(nèi)均有流出(見(jiàn)圖1A、C)。而對(duì)于蛋白吸入膠內(nèi)酶切法制備的多肽樣品,只在前55 min有機(jī)相濃度低于30%時(shí)出峰,后面高有機(jī)相時(shí)很少有肽段流出(見(jiàn)圖1B),說(shuō)明在樣品制備過(guò)程中疏水性肽段丟失嚴(yán)重。由表1的鑒定蛋白數(shù)也可看出細(xì)胞吸入膠內(nèi)酶切法及超濾管輔助溶液酶切法明顯優(yōu)于蛋白吸入膠內(nèi)酶切法。

2.2 三種酶切法所得樣品鑒定蛋白韋恩圖分析

將三種酶切法所得樣品鑒定的蛋白進(jìn)行在線韋恩圖分析(見(jiàn)圖2),顯示不同酶切方法得到的蛋白種類(lèi)均有差異,即使鑒定數(shù)較少的蛋白吸入膠內(nèi)酶切法,最后鑒定到的蛋白也有421種是另兩種方法未鑒定到的。雖然酶切過(guò)程可能丟失了部分蛋白,但該方法仍檢測(cè)到部分用其他方法未鑒定到的蛋白。由于蛋白質(zhì)種類(lèi)繁多、理化性質(zhì)各異,要想實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞全蛋白質(zhì)組的深度覆蓋,需要能規(guī)避蛋白提取的偏好性以及實(shí)驗(yàn)流程中樣品的丟失問(wèn)題[2]。

2.3 兩種較優(yōu)酶切方法所得樣品鑒定的蛋白Gene Ontology分析

對(duì)兩種鑒定蛋白數(shù)較多的酶切方法所鑒定到的全部蛋白進(jìn)行Gene Ontology分析,采用細(xì)胞吸入膠內(nèi)酶切法制備的樣品共鑒定到3 835個(gè)蛋白,其中3 826個(gè)蛋白可進(jìn)行GO分析,采用超濾管輔助溶液酶切法制備的樣品共鑒定到4 248個(gè)蛋白,其中4 233個(gè)蛋白可進(jìn)行GO分析。細(xì)胞定位分析結(jié)果表明:在細(xì)胞定位趨勢(shì)上,兩種酶切方法所制備樣品的蛋白鑒定結(jié)果較為一致,超濾管輔助溶液酶切法制備樣品所鑒定的蛋白總數(shù)略多,總蛋白在細(xì)胞定位之后,大多類(lèi)蛋白數(shù)目也略多于細(xì)胞吸入膠內(nèi)酶切制備的樣品,但細(xì)胞吸入膠內(nèi)酶切法卻鑒定到了更多的膜組分相關(guān)蛋白(見(jiàn)圖3),提示該方法能獲得更多膜結(jié)合蛋白。

表1 三種酶切方法所得多肽樣品液質(zhì)聯(lián)用鑒定蛋白數(shù)、多肽數(shù)及譜圖數(shù)Table 1 The proteins,peptides,spectra identified by LC-MS/MS from the samples prepared by three digestion methods

藍(lán)色線表示一級(jí)TIC,紫色線表示二級(jí)TIC圖1 三種酶切方法所得多肽樣品液相總離子流圖Figure 1 Total ions chromatogram(TIC) of peptides obtained by three digestion methods

cell-absorb:細(xì)胞吸入膠內(nèi)酶切法;pro-absorb:蛋白吸入膠內(nèi)酶切方法;FASP:超濾管輔助溶液酶切法圖2 三種酶切法所得樣品鑒定蛋白的韋恩圖Figure 2 Venn diagram analysis of proteins identified from samples prepared using three digestion methods

圖3 兩種酶切法鑒定蛋白GO分類(lèi)Figure 3 The GO analysis of proteins identified from samples prepared by the two digestion methods

3 討論

此三種酶切方法均未使用去污劑,因此避免了去污劑的種種弊端。就全細(xì)胞的蛋白鑒定整體性而言,需要鑒定到越多蛋白越好,所以超濾管輔助溶液酶切法和細(xì)胞吸入膠內(nèi)酶切法更優(yōu),后一種方法在鑒定多肽數(shù)及平均匹配肽段數(shù)上更勝一籌,這對(duì)于一些需要覆蓋更多肽段來(lái)確定某些修飾位點(diǎn)的蛋白鑒定更為有利。

對(duì)于同是以干膠粒作為介質(zhì)的兩種酶切方法,細(xì)胞吸入膠內(nèi)酶切法經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融破碎細(xì)胞,未加入變性劑,許多蛋白會(huì)以蛋白復(fù)合體的形式進(jìn)入凝膠碎片中。因?yàn)槟z中蛋白復(fù)合體的分子質(zhì)量更大,且有一定的空間結(jié)構(gòu)。在用梯度乙腈洗滌凝膠的時(shí)候,蛋白復(fù)合體會(huì)比蛋白更容易被保留,所以細(xì)胞吸入膠內(nèi)酶切法制備樣品蛋白不易丟失[3]。而蛋白吸入膠內(nèi)酶切法制備的多肽樣品疏水性肽段丟失嚴(yán)重,這可能是因?yàn)榈鞍滋崛∵^(guò)程中經(jīng)過(guò)變性之后,長(zhǎng)鏈蛋白分子不容易進(jìn)入凝膠,一些蛋白在用梯度乙腈洗滌的時(shí)候丟失了。這在液質(zhì)上樣前多肽樣品經(jīng)NanoDrop進(jìn)行蛋白定量時(shí)也有所體現(xiàn),相同量的蛋白裂解液進(jìn)行蛋白吸入膠內(nèi)酶切后得到的多肽量不足1 μg,而采用超濾管輔助溶液酶切后得到多肽量為29.1 μg,多次實(shí)驗(yàn)均為類(lèi)似結(jié)果(結(jié)果未展示)。文獻(xiàn)中采用的蛋白吸入膠內(nèi)酶切法未見(jiàn)蛋白丟失現(xiàn)象,可能是其蛋白抽提過(guò)程使用了去污劑SDS所致[3,7,10]。本實(shí)驗(yàn)用的變性劑是尿素,裂解出的蛋白種類(lèi)和數(shù)量可能會(huì)有不同,在被干膠粒吸收后進(jìn)入凝膠的深淺也會(huì)不同,在洗滌膠粒的過(guò)程中,一些未進(jìn)入凝膠深層的疏水性蛋白更易被乙腈洗脫掉,這種推測(cè)有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。