彭先兵,戴潤芝

(十堰市人民醫(yī)院,湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院耳鼻喉科,十堰 442000;*通訊作者,E-mail:pengxianbin1@126.com)

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有一定相關(guān)性[1-3]。鼻咽癌細胞產(chǎn)生的microRNA包括兩類:由宿主細胞基因組產(chǎn)生的microRNA;由EBV基因組產(chǎn)生的microRNA,此類microRNA是由Bam HIA區(qū)編碼,將其命名為bart microRNAs。bart microRNAs可分泌至細胞外,研究人員在鼻咽癌種植瘤裸鼠的外周血以及細胞培養(yǎng)液中均發(fā)現(xiàn)了多種bart microRNAs的高水平表達,并提出microRNA bart7在其中表達量最高[4,5]。相較于非鼻咽癌人群,鼻咽癌患者血漿microRNA bart7水平增加,推斷microRNA bart7水平與鼻咽癌發(fā)生密切相關(guān)。目前針對EBV以及microRNA bart7的研究主要集中在鼻咽癌的診斷方面[6,7],關(guān)于治療的監(jiān)測以及放療敏感性方面的研究尚不多見。本研究以鼻咽癌患者為研究對象,探討血漿EBV/DMA表達水平不同對其放療敏感性的影響,并從其編碼的microRNA bart7方面進一步分析其影響機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究選取2017-03～2017-10期間我院收治的75例鼻咽癌患者以及同期入院體檢的30例健康人群為研究對象。入組標準:①符合診斷標準的鼻咽癌患者[8];②首次接受治療者;③卡氏(KPS)評分>60分者;④隨訪資料完整者。排除標準:①術(shù)前檢查發(fā)現(xiàn)罹患有嚴重糖尿病、高血壓者;②合并神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病者;③肝炎、結(jié)核等病史;④合并其他惡性腫瘤患者。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準,且受試者均已簽署書面知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 熒光定量PCR技術(shù)檢測健康人群以及放療前、后鼻咽癌患者血漿EBV/DNA陽性 ①提取DNA:全部受試者各取2 ml外周血,置于EDTA抗凝管內(nèi),采用低溫高速離心機進行離心,取血漿保存于-20 ℃冰箱中待測;取出待測血漿于4 ℃條件下解凍,向待測標本管內(nèi)加入50 μl DNA提取液(上海生工生物工程股份有限公司),操作方法嚴格按照DNA提取試劑盒說明進行。②熒光定量PCR:目的基因為EBV/DNA的EBNA-1片段,正向引物:5′-GTAGAAGGCCATTTTTCCAC-3′;反向引物:5′-TTTCTACGTGACTCCTAGCC-3′。雙熒光標記探針序列為:5′-(FAM)ACCACCGTGGCCCAGATGG(TAMRA)-3′。熒光定量PCR反應(yīng)條件如下:93 ℃,2 min,1次循環(huán);93 ℃ 45 s,55 ℃ 60 s,10次循環(huán);93 ℃ 30 s、55 ℃ 45 s,30次循環(huán)。熒光定量PCR試劑盒及熒光定量PCR儀購自上海生工生物工程股份有限公司,檢測步驟、質(zhì)控方法以及結(jié)果判讀嚴格按照說明書進行。檢測臨界值為5×102copies/μl,EBV/DNA陽性及檢測結(jié)果≥5×102copies/μl。

1.2.2 實時熒光定量PCR技術(shù)檢測放療前、后鼻咽癌患者血漿中microRNA-BART7表達 ①RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):全部受試者各取400 μl血漿,采用mir Vanami RNA提取試劑盒(Ambion,Austin,Tex)提取血漿總RNA,操作方法嚴格按照試劑盒說明進行。取40 ng RNA樣本,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用TaqMan microRNA檢測試劑盒(AppliedBiosystems,FosterCity,Calif)進行,特異性莖環(huán)引物與探針按照miRBase數(shù)據(jù)庫中搜集的成熟EBV-miRNAs進行設(shè)計。②實時熒光定量PCR:目的片段來自EBV-miRNAs成熟體,內(nèi)參為RNU6B。為提升血漿中miRNA豐度,首先采用TaqMan Pre Amp Master Mix(Applied Biosystems)對其進行預(yù)擴增,反應(yīng)條件如下:50 ℃ 3 min、95 ℃ 10 min,12次循環(huán)95 ℃ 15 s,60 ℃ 2 min。以1 ∶2的比例對預(yù)擴增產(chǎn)物進行稀釋,20 μl miRNA反應(yīng)體系如下:稀釋產(chǎn)物5 μl,熱啟動Taq聚合酶8 U,dATP、dGTP、dUTP、dCTP各200 μmol,10×Realtime PCR緩沖液2 μl,引物5 pmol,探針5 pmol。采用ABI7500熒光定量PCR儀進行擴增。反應(yīng)條件:95 ℃處理10 min后熱啟動;94 ℃處理2 min后完成變性;93 ℃下處理40 s,56 ℃處理45 s,4 ℃處理30 min,如此循環(huán)35次。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA法)測定EBV相關(guān)腫瘤標志物表達水平 血清EBV VCA-IgA、EA-IgA、Rta-IgG分別采用抗EBV衣殼抗原抗體Ig A試劑盒、抗EBV早期抗原IgA抗體試劑盒以及EBV Rta蛋白抗體IG試劑盒進行測定,檢測試劑盒均購自同昕生物技術(shù)(北京)有限公司。EBV VCA-IgA、EA-IgA表達檢測按照1 ∶100的比例加入樣本緩沖液稀釋血清標本,Rta-IgG表達檢測按照1 ∶9的比例加入樣本緩沖液稀釋血清標本,分別于微孔內(nèi)加入稀釋后的樣本、陽性對照以及陰性對照各100 μl,室溫條件下溫育30 min,采用洗板機(奧地利,型號:anthosfruido)進行洗板,顯色終止后采用anthos 2010型酶標儀測定光密度值。EBV VCA-IgA、EA-IgA陽性判定標準為S/CO≥0.8,Rta-IgG陽性判定標準為S/CO≥1。

1.3 統(tǒng)計學分析

本研究中數(shù)據(jù)全部采用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件(美國IBM公司)進行處理;計數(shù)資料采用率(%)表示,組間比較采用χ2分析;利用相關(guān)性分析探究EBV/DNA陽性檢出率與microRNA-BART7、EBV VCA-IgA、EA-IgA、Rta-IgG陽性檢出率之間的相關(guān)性;P<0.05代表差異存在統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌患者與健康人群血漿EBV/DNA陽性率比較

健康人群、鼻咽癌患者中EBV/DNA陽性患者數(shù)分別為1例和69例,鼻咽癌患者血漿EBV/DNA比率高于健康人群(92.00%vs3.33%),且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表1)。

2.2 鼻咽癌患者放療前后血漿EBV/DNA陽性率比較

放療前、放療后鼻咽癌患者中EBV/DNA陽性患者數(shù)分別為69例和23例,放療后鼻咽癌患者血漿EBV/DNA陽性率低于放療前(30.67%vs92.00%),且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表2)。

表1 鼻咽癌患者與健康人群血漿EBV/DNA陽性率比較 例(%)Table 1 Comparison of plasma EBV/DNA positive rate between nasopharyngeal cancer patients and healthy subjects cases(%)

表2 鼻咽癌患者放療前后EBV/DNA陽性率比較 例(%)Table 2 Comparison of EBV/DNA positive rates in nasopharyngeal cancer patients before and after radiotherapy cases(%)

2.3 不同放療效果鼻咽癌患者血漿EBV/DNA陽性率比較

放療后持續(xù)緩解、復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者中EBV/DNA陽性患者數(shù)分別為3例和20例,放療后持續(xù)緩解的鼻咽癌患者血漿EBV/DNA陽性率低于復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移者(12.50%vs39.22%),且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表3)。

表3 不同放療效果鼻咽癌患者血漿EBV/DNA陽性率比較 例(%)Table 3 Comparison of positive rates of plasma EBV/DNA in nasopharyngeal carcinoma patients with different radiotherapy effects cases(%)

2.4 鼻咽癌患者放療前后EBV相關(guān)腫瘤標志物陽性率比較

放療前,鼻咽癌患者血漿microRNA bart7、EBV VCA IgA、EBV EA IgA、EBV Rta IgG陽性率均低于放療前,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表4)。

2.5 不同放療效果鼻咽癌患者EBV相關(guān)腫瘤標志物陽性率比較

放療后,持續(xù)緩解的鼻咽癌患者血漿microRNA bart7、EBV VCA IgA、EBV EA IgA、EBV Rta IgG陽性率均高于持續(xù)緩解者,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表5)。

表4 鼻咽癌患者放療前后EBV相關(guān)腫瘤標志物陽性率比較 例(%)Table 4 Comparison of positive rate of EBV-related tumor markers in nasopharyngeal cancer patients before and after radiotherapy cases(%)

表5 不同放療效果鼻咽癌患者EBV相關(guān)腫瘤標志物陽性率比較 例(%)Table 5 Comparison of positive rates of ebv-related tumor markers in nasopharyngeal cancer patients with different radiotherapy effects cases(%)

2.6 EBV/DNA陽性率與EBV相關(guān)腫瘤標志物陽性率的相關(guān)性分析

EBV/DNA陽性率與microRNA bart7陽性率呈正相關(guān)(r=0.461,P<0.05),未發(fā)現(xiàn)EBV/DNA陽性率與EBV VCA IgA、EBV EA IgA、EBV Rta IgG等腫瘤標志物之間的相關(guān)性(P>0.05,見表6)。

表6 EBV/DNA陽性率與EBV相關(guān)腫瘤標志物水平的相關(guān)性分析Table 6 Correlation between EBV/DNA positive rate and EBV related tumor markers

3 討論

放療是治療鼻咽癌的主要方式,患者治療失敗的主要原因為局部或區(qū)域復(fù)發(fā)以及遠處轉(zhuǎn)移。約有40%-50%完全緩解的患者后期可能會發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,造成治療失敗。目前臨床中診斷鼻咽癌患者治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的方式效果不佳。研究證實[9,10],鼻咽癌患者血漿EBV/DNA水平能夠?qū)梢阅[瘤負荷進行準確反應(yīng),隨著腫瘤的清除而EBV/DNA水平可在短期內(nèi)降低至低于檢測極限值,由此可以推斷,鼻咽癌患者治療后在血漿檢測到EBV/DNA則可能意味著已經(jīng)發(fā)生了復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[11]。本研究中,鼻咽癌患者血漿EBV/DNA陽性率為92.00%,而健康人群中血漿EBV/DNA均為陰性,再次證實EBV/DNA與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn),放療后鼻咽癌患者血漿microRNA bart7、EBV VCA IgA、EBV EA IgA、EBV Rta IgG陽性率均低于放療前(P<0.05)。放療后,持續(xù)緩解的鼻咽癌患者血漿microRNA bart7、EBV VCA IgA、EBV EA IgA、EBV Rta IgG陽性率均低于復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移者。EBV/DNA陽性率與microRNA bart7陽性率呈正相關(guān)。這說明通過化療可有效降低EBV/DNA水平,且通過檢測EBV/DNA水平能夠?qū)颊叻暖煹牟煌ЧM行有效區(qū)分。故對于檢測結(jié)果為EBV/DNA陽性者,應(yīng)進行進一步的臨床與影像學檢查,以評估患者是否發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移。相較于EBV/DNA陰性患者來說,EBV/DNA陽性者在短期內(nèi)發(fā)生疾病進展的風險較高,醫(yī)護人員應(yīng)對此類患者進行密切觀察,應(yīng)提醒患者注意定期入院復(fù)查以實現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)早治療的目的[12,13]。EBV bart microRNAs由對宿主細胞進行潛伏感染的EBV基因組進行編碼,bart microRNAs的主要特點包括[14-16]:bart microRNAs在鼻咽癌中表達較高,而在EBV感染的其他腫瘤中水平則較低;bart microRNAs在鼻咽癌患者癌旁組織以及正常鼻咽黏膜中均不表達,僅在在鼻咽癌組織中高表達;細胞中bart microRNAs表達水平與鼻咽癌細胞分泌且進入exosome的表達水平較為一致。鼻咽癌細胞所分泌的bart microRNAs可進入血液循環(huán),并與腫瘤組織中的表達水平有一定的相關(guān)性。在多種EBV感染的細胞株以及培養(yǎng)液中存在microRNA bart7的高表達,證實microRNA bart7能夠分泌至細胞外,并呈現(xiàn)較高的表達水平[17,18]。

本研究還顯示,鼻咽癌患者放療前microRNA bart7高表達,而放療后則下降,且放療后持續(xù)緩解的鼻咽癌患者血漿microRNA bart7陽性率低于復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移。由此可以推斷存活的鼻咽癌細胞可能將microRNA bart7分泌至血液[19,20]。鼻咽癌患者放療后,存活細胞的殘留情況對患者治療方案的選擇來說尤為重要。本研究說明鼻咽癌患者放療后腫瘤殘留情況血漿microRNA bart7表達水平相關(guān),其原因是放療后,腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者存活的鼻咽癌細胞數(shù)量高于放療后緩解者。因此,監(jiān)測血漿miRNA-BART7表達水平有利于反映鼻咽癌患者放療后疾病進展情況。即miRNA-BART7可能是由存活的鼻咽癌細胞分泌至血液。鼻咽癌放療結(jié)束時,判斷是否還殘留一定量的存活細胞對臨床上制定放療后的治療方案至關(guān)重要。miRNA-BART7濃度與腫瘤負荷相關(guān),且鼻咽癌放療結(jié)束時血漿miRNA-BART7表達水平與腫瘤殘留相關(guān)。此外,當腫瘤體積巨大時時,放療后血漿miR-BART7下降到<50拷貝數(shù)以下的概率微小?？赡苁且驗槟[瘤體積巨大者,放療結(jié)束后腫瘤無法達到完全緩解,即仍存在一定數(shù)目的存活鼻咽癌細胞,提示血漿miRNA-BART7是監(jiān)測鼻咽癌治療療效和早期發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的潛在指標。

綜上所述,放療后持續(xù)緩解的鼻咽癌患者血漿EBV/DNA、microRNA bart7陽性率低于復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移者,EBV可能通過調(diào)節(jié)其編碼的microRNA bart7水平對鼻咽癌患者放療敏感性產(chǎn)生影響,故臨床中可通過測定血漿microRNA bart7水平預(yù)測患者放療效果。