高 艷,楊 洋,延佳佳,劉成娟

(1 西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院超聲科,西安 710077;2 西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科;3 空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科;*通訊作者,E-mail:liuchengjuan@sina.com)

子癇前期(pre-eclapmpsia,PE)為產(chǎn)科常見疾病,其發(fā)病原因尚未明確[1,2]。滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡增加,導(dǎo)致細(xì)胞浸潤能力下降、子宮螺旋動脈重塑異常,最終致胎盤功能障礙可能為PE的病理基礎(chǔ)和主要病因?qū)W說[3,4]。在妊娠早期,正常功能的滋養(yǎng)細(xì)胞保證了胎盤形成及正常妊娠的成功;而滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡嚴(yán)重程度則與PE疾病呈相關(guān)性[5]。相關(guān)研究表明,微小RNA(miRNA)能夠影響滋養(yǎng)細(xì)胞功能,可能與PE發(fā)生相關(guān)[6,7]。本課題組前期研究表明,在PE胎盤組織中miR-18a呈病理性低表達(dá)[8],抑制miR-18a的表達(dá)能夠增加HTR8細(xì)胞的凋亡率[9]。Song等[10]發(fā)現(xiàn),miR-18a能夠通過靶向調(diào)控再生蛋白(Neogenin),影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞浸潤和凋亡。作為結(jié)直腸癌缺失蛋白(deleted in colorectal cancer,DCC)的同源物,Neogenin及其配體在人胎盤組織及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞中均有表達(dá),并參與調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡[11]。

因此,本研究在前期已明確miR-18a與PE的相關(guān)性,及其對滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡能力具有影響作用的基礎(chǔ)上,擬分析miR-18a是否能夠通過影響Neogenin的表達(dá),進(jìn)而參與滋養(yǎng)細(xì)胞功能調(diào)節(jié)過程。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑、儀器

HTR8細(xì)胞由空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科惠贈。DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司;TRIzol Reagent購自美國Invitrogen公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光實時定量PCR反應(yīng)試劑盒購自日本TaKaRa公司;miR-18a mimics、inhibitor及羧基熒光素(carboxyfluorescein,FAM)標(biāo)記microRNA NC購自上海吉瑪生物公司;Opti-MEM培養(yǎng)基及LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司;細(xì)胞裂解液、蛋白定量試劑盒購自科昊生物公司;FITC-兔抗人neogenin單克隆抗體、兔抗人GADPH單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體購自英國Abcam公司;實時熒光定量PCR分析儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 HTR8細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將凍存的HTR8細(xì)胞解凍后接種于RPMI-1640完全培養(yǎng)液(含10% FBS),調(diào)整細(xì)胞數(shù)后接種于培養(yǎng)皿中,5% CO2、37 ℃培養(yǎng)；待細(xì)胞生長密度至70%左右時行轉(zhuǎn)染實驗。轉(zhuǎn)染實驗選取6孔板進(jìn)行。分為三組:miR-18a過表達(dá)組(mimics組)、miR-18a抑制組(Inhibitor組)、陰性對照組(NC組)。消化待轉(zhuǎn)染HTR-8細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度,按照LipofectamineTM2000說明書配制轉(zhuǎn)染試劑,配制時避光進(jìn)行;將轉(zhuǎn)染液逐一加入到對應(yīng)的6孔板孔中,并設(shè)置陰性對照,隨即將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱,初次培養(yǎng)6 h,第一次換液為RPMI1640完全培養(yǎng)液(含10% FBS);隨即于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率、記錄結(jié)果。

1.3 RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染后HTR8細(xì)胞中miR-18a、Neogenin mRNA的表達(dá)

轉(zhuǎn)染后48 h使用TRIzol Reagent提取HTR-8細(xì)胞總RNA,測定RNA質(zhì)量后保存待用。根據(jù)PrimerBank公布的基因序列設(shè)計miR-18a、Neogenin及內(nèi)參U6、β-actin的引物序列,具體序列見表1;PCR引物北京奧科公司合成。

吸取1 μl總RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成miR-18a cDNA;根據(jù)TaKaRa實時定量PCR試劑盒說明配制反應(yīng)體系后加樣,以U6為內(nèi)參,進(jìn)行PCR反應(yīng),具體反應(yīng)條件見表1。

每次檢測設(shè)定3個復(fù)孔,每個樣本重復(fù)3次。以上在每個PCR循環(huán)的延伸期采集熒光信號,PCR反應(yīng)完成后利用溫度梯度變性獲得溶解曲線供PCR產(chǎn)物定性分析。根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線,得到每個樣本的循環(huán)周期數(shù)(Cq值),使用2-ΔΔCt法計算各組中目的基因mRNA(miR-18a、Neogenin)的表達(dá)水平情況。

表1 目的基因引物序列及PCR反應(yīng)條件Table 1 Target gene primer sequences and PCR reaction conditions

1.4 Western blot檢測過表達(dá)與抑制miR-18a后HTR8細(xì)胞中Neogenin蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染后48 h使用細(xì)胞裂解液提取HTR-8細(xì)胞蛋白,并檢測蛋白濃度。取30 μg蛋白電泳進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresi,SDS-PAGE),半干法轉(zhuǎn)至PVDF上,將膜置于含5%脫脂奶粉封閉液中,封閉1 h；加一抗兔抗人Neogenin單抗(1 ∶2 500)、兔抗人GADPH單抗(1 ∶1 500)，室溫孵育2 h；洗滌一抗后加HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1 ∶5 000)二抗孵育1 h；化學(xué)發(fā)光反應(yīng)后，顯影、定影，用BIO-RAD成像系統(tǒng)對X線片掃描成像，記錄灰度值并行半定量分析，目的蛋白的表達(dá)量以Neogenin/GADPH比值表示。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-18a轉(zhuǎn)染效率

HTR8細(xì)胞中過表達(dá)與抑制miR-18a后6 h,于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率約為90%(FAM熒光素酶標(biāo)記),見圖1。

圖1 HTR-8細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 (×200)Figure 1 HTR-8 cell transfection efficiency (×200)

2.2 轉(zhuǎn)染后miR-18a mRNA水平的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示,與對照組(NC)(0.61 ±0.07)相比,mimics組(1.04 ±0.13)miR-18a表達(dá)明顯升高，inhibitor組(0.35 ±0.05)miR-18a表達(dá)降低，三組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=73.13,P<0.01,見圖2)。

與NC組比較，* P<0.01;與mimics比較，#P<0.05圖2 miR-18a mRNA在HTR8細(xì)胞中水平Figure 2 Levels of miR-18a mRNA in HTR8 cells after different treatment

2.3 抑制miR-18a可增加HTR8細(xì)胞中Neogenin在蛋白表達(dá)水平

RT-qPCR結(jié)果顯示,與NC組(0.91 ±0.15)相比,mimics組(0.92 ±0.09)和inhibitor組(0.91 ±0.12)Neogenin在mRNA水平無明顯變化(F=0.011,P>0.05,見圖3)。

Western blot結(jié)果顯示,與NC組(0.73 ±0.06)相比,inhibitor組Neogenin表達(dá)水平升高(1.18 ±0.40),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.88,P<0.05,見圖4)。

圖3 過表達(dá)或抑制miR-18a后Neogenin在mRNA水平表達(dá)Figure 3 Expression of Neogenin at mRNA level after overexpression or inhibition of miR-18a

與其他兩組比較，* P<0.05圖4 過表達(dá)或抑制miR-18a后Neogenin蛋白表達(dá)水平Figure 4 Neogenin protein expression level after overexpression or inhibition of miR-18a

3 討論

作為常見的妊娠期疾病,PE在我國發(fā)生率較高[12],因其病因不明,且缺乏安全有效的早期診斷預(yù)測方法,往往發(fā)病時孕婦機(jī)體已發(fā)生了不可逆轉(zhuǎn)的病理生理變化,故而其導(dǎo)致圍生期母嬰死亡率較高[13],臨床并發(fā)癥多。近年來,關(guān)于PE的病因?qū)W研究領(lǐng)域取得了一定進(jìn)展,滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡增加、侵襲能力下降,導(dǎo)致胎盤功能異常,而引發(fā)一系列機(jī)體變化,逐漸成為其主要病因?qū)W說。miRNA能夠通過影響滋養(yǎng)細(xì)胞功能涉及胎盤淺著床、子宮螺旋動脈重鑄障礙等一系列病理過程[6,7],其主要通過對靶基因的調(diào)控作用,影響人體多種生理過程,參與包括PE在內(nèi)的諸多疾病過程。PE時,Zhu等[8]研究表明PE胎盤組織中存在低表達(dá)的miR-18a,后續(xù)有研究進(jìn)一步驗證了其與PE的相關(guān)性[14]。此外,體外細(xì)胞功能試驗驗證了抑制miR-18a的表達(dá)可明顯增加HTR8細(xì)胞凋亡[9]。提示PE相關(guān)miR-18a能夠通過其某些靶基因介導(dǎo),共同影響滋養(yǎng)細(xì)胞功能。

而miR-18a作為PE相關(guān)性因子,其靶基因再生蛋白Neogenin是一種具有多種生物學(xué)功能的受體,屬于結(jié)直腸癌缺失蛋白(DCC)家族成員,其通過與其多種配體相結(jié)合,在多種器官組織發(fā)育分化、細(xì)胞遷移、血管形成以及細(xì)胞凋亡等生理過程中發(fā)揮重要作用[15]。這提示Neogenin可能也與PE相關(guān)。在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-18a與Neogenin的靶向關(guān)系已得到明確,且Neogenin對膠質(zhì)瘤細(xì)胞功能直接具有影響[10]。本研究表明,抑制miR-18a的表達(dá)能夠影響人正常滋養(yǎng)細(xì)胞中Neogenin在蛋白水平的表達(dá)(P<0.05);這與上述研究結(jié)果[10]部分一致,提示更換細(xì)胞平臺后,miR-18a與Neogenin之間仍具有靶向調(diào)控作用。那么Neogenin是否能夠通過miR-18a調(diào)控途徑與參與PE疾病呢?

Neogenin定位于胎盤及滋養(yǎng)細(xì)胞中,參與胎盤形成過程,并與胎兒生長受限、子癇前期等多種病理妊娠相關(guān)[16];其對滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過程也具有影響作用[11]。另外,鐘少平等[17]研究中指出,Neogenin可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡。而高水平的Neogenin則能夠通過其與凋亡相關(guān)蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAPK)之間的相互作用[18]共同加強(qiáng)細(xì)胞凋亡過程,進(jìn)而影響正常妊娠。本研究中則驗證了miR-18a對人滋養(yǎng)細(xì)胞中Neogenin蛋白水平的表達(dá)存在影響。因此,結(jié)合本研究中結(jié)果,有如下推論:PE時,滋養(yǎng)細(xì)胞中病理性低表達(dá)的miR-18a可能通過其在翻譯水平對Neogenin的負(fù)性調(diào)控,使胎盤局部微環(huán)境中Neogenin水平升高,并進(jìn)一步通過自身刺激促進(jìn)胎盤其他組織部位分泌更多的Neogenin[19];而高水平的Neogenin則能夠通過DAPK途徑[18],加速滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過程,影響胎盤螺旋動脈重鑄,引發(fā)PE產(chǎn)生。miR-18a可能通過上述途徑影響滋養(yǎng)細(xì)胞功能,參與PE疾病過程。

綜上所述,本研究進(jìn)一步探討了miR-18a與PE的相關(guān)性,驗證了miR-18a對人滋養(yǎng)細(xì)胞中Neogenin的表達(dá)存在影響;在Neogenin能夠影響滋養(yǎng)細(xì)胞功能已得到證實的基礎(chǔ)上,本研究為進(jìn)一步探索PE病因,以及miRNA在該疾病預(yù)測、臨床診治中應(yīng)用,提供了部分思路。但具體涉及的機(jī)制研究,仍需在后續(xù)的實驗中不斷完善。