王偉青,楚 曉,向 明,馮 亮,劉俊鈞

(復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院胸外科,上海 200240;*通訊作者,E-mail:w17348030234@163.com)

近50年來(lái)，肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年增加，已經(jīng)超過(guò)其他腫瘤，成為威脅人類健康的殺手之一，據(jù)人群統(tǒng)計(jì)學(xué)大數(shù)據(jù)顯示，男性人群中肺癌的發(fā)病率和死亡率占所有惡性腫瘤的第一位；女性人群中肺癌占據(jù)第二位[1-3]。尋找更好的基因治療靶點(diǎn)，為臨床上肺癌患者提供新的治療思路，仍然具有十分重要的意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)被認(rèn)為可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡和轉(zhuǎn)移。有研究證明,lncRNA PRNCR1與直腸癌、食管癌、肝癌等癌癥密切相關(guān)[4-6]。然而,尚沒(méi)有研究涉及l(fā)ncRNA PRNCR1在非小細(xì)胞肺癌發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究。本研究利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù),構(gòu)建lncRNA PRNCR1的shRNA干擾表達(dá)載體,探究lncRNA PRNCR1對(duì)肺癌細(xì)胞遷移和凋亡的影響,為肺癌的治療提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;TRIzol提取試劑盒,TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaKaRa熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司;Transwell小室試劑盒購(gòu)自美國(guó)康寧公司;lncRNA PRNCR1,Caspase-3和Caspase-9山羊抗人一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;AV-PI試劑盒購(gòu)自中國(guó)杭州聯(lián)科生物有限公司。

1.2 肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的培養(yǎng)

人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549,購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究院。細(xì)胞經(jīng)離心收集后,以2×104/cm2的密度將其種植于25 cm×25 cm的培養(yǎng)瓶中。加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,而后將細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 shRNA lncRNA PRNCR1慢病毒載體構(gòu)建

shRNA lncRNA PRNCR1質(zhì)粒是由上海吉?jiǎng)P公司合成,選擇pHBLV-U6-GFP-PGK-Puro作為質(zhì)粒的克隆載體。shRNA lncRNA PRNCR1載體病毒載體的克隆切入點(diǎn)是XhoⅠ/BamHⅠ,環(huán)狀載體編號(hào)為ENST00000001179。經(jīng)過(guò)基因測(cè)序,從而證明序列的正確性。

1.4 試驗(yàn)分組

將人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞分成三組:空白對(duì)照組,陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。空白對(duì)照組為未做任何處理的細(xì)胞組,陰性對(duì)照組是經(jīng)空白載體的慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組,實(shí)驗(yàn)組是由shRNA lncRNA PRNCR1的慢病毒干擾載體構(gòu)建的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組。以GFP為慢病毒熒光探針,用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞慢病毒的轉(zhuǎn)染效率。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

三組細(xì)胞在融合率達(dá)80%以上后，用0.25%胰蛋白酶消化后放入15 ml離心管，加入1 ml的TRIzol RNAiso，裂解細(xì)胞，提取RNA后根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)，將逆轉(zhuǎn)錄的cDNA保存在4 ℃冰箱中備用。根據(jù)TaKaRa熒光定量PCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)的要求，采用20 μl的反應(yīng)體系，加入各樣品。進(jìn)行熒光定量PCR的檢測(cè)。采用FS2000系統(tǒng)對(duì)PCR進(jìn)行分析，反應(yīng)條件預(yù)設(shè)為預(yù)變性95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s， 40個(gè)循環(huán)。溶解曲線：95 ℃ 5 s； 60 ℃ 1 min。降溫：50 ℃ 30 s,1個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因GAPDH和lncRNA PRNCR1引物由上海生工公司生產(chǎn)(見(jiàn)表1)。采用2-ΔΔCt的方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物名稱和序列Table 1 Primer names and sequences

1.6 Western-blot檢測(cè)lncRNA PRNCR1、Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達(dá)水平

三組細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后，加入RIPA細(xì)胞裂解液1 ml，各組細(xì)胞在冰上裂解30 min，收集入1.5 ml離心管中，4 ℃，5 000 r/min離心5 min，取上清，95 ℃煮沸，-80 ℃保存，按照說(shuō)明書(shū)制備濃縮膠10 ml，分離膠20 ml。上樣后交流電電泳分離，轉(zhuǎn)PVDF膜，lncRNA PRNCR1，Caspase-3和Caspase-9的一抗(1 ∶5 000稀釋)加入樣本PVDF膜，4 ℃避光孵育過(guò)夜(>12 h)。用PBST稀釋液洗膜，重復(fù)3次，加用兔抗山羊HRP二抗(1 ∶1 000稀釋)，常溫避光孵育1.5 h，PBST洗滌3次，DAB顯影。用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.7 Transwell小室試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移

將空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后收集，按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)，將基底膜的基質(zhì)原液放在冷藏冰箱(4 ℃)過(guò)夜融化，與預(yù)冷的無(wú)血清的RPMI1640按照1 ∶3的比例配置侵襲上室凝膠液體，以每孔55 μl凝膠包被Transwell小室的上室，37 ℃孵育2 h，使上室成膠。上室每孔接種200 μl不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，下室加入10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液500 μl。Transwell板置37 ℃孵育24 h，用結(jié)晶紫染色。將Transwell板用倒置光學(xué)顯微鏡，拍照，細(xì)胞計(jì)數(shù)。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.8 AV-PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的凋亡

將空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后收集,按照AV-PI的試劑盒的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)三組細(xì)胞的凋亡率。流式細(xì)胞儀分析各組樣本,計(jì)算各組的凋亡率。Annexin Ⅴ+/PI-為早期凋亡細(xì)胞,Annexin Ⅴ+/PI+為晚期凋亡和壞死細(xì)胞,Annexin Ⅴ-/PI+為正常細(xì)胞。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 慢病毒干擾載體的轉(zhuǎn)染結(jié)果

以綠色熒光蛋白(GFP)為熒光探針,完成lncRNA PRNCR1的沉默表達(dá)的慢病毒載體的構(gòu)建。慢病毒轉(zhuǎn)染效率較高,以人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象,慢病毒轉(zhuǎn)染率見(jiàn)圖1。shRNA-lncRNA PRNCR1載體慢病毒轉(zhuǎn)染滴度為3×108TU/ml。

A.熒光視野 B.白光視野圖1 慢病毒干擾載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞結(jié)果 (×200)Figure 1 Lentivirus interference vector transfected A549 cells (×200)

2.2 凋亡因子Caspase-3,Caspase-9以及l(fā)ncRNA PRNCR1基因的表達(dá)水平

空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的lncRNA PRNCR1的mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=9.299,P<0.05,見(jiàn)圖2),其中實(shí)驗(yàn)組lncRNA PRNCR1的mRNA的相對(duì)表達(dá)量要明顯低于陰性對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.997,P=0.017 9)?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的Caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=11.003,P<0.05),實(shí)驗(yàn)組Caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量要明顯高于陰性對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.086,P=0.014 9)。空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組間Caspase-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=9.001,P<0.05),實(shí)驗(yàn)組Caspase-9的mRNA的相對(duì)表達(dá)量要明顯高于陰性對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.172,P=0.021 4)。

2.3 凋亡因子Caspase-3,Caspase-9以及l(fā)ncRNA PRNCR1的蛋白表達(dá)水平

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的lncRNA PRNCR1蛋白表達(dá)量比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=9.087,P<0.05),實(shí)驗(yàn)組的lncRNA PRNCR1蛋白表達(dá)量要明顯低于陰性對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.129,P=0.022 4)?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=9.793,P<0.05),實(shí)驗(yàn)組Caspase-3蛋白表達(dá)量要明顯高于陰性對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.827,P=0.012 9)?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的Caspase-9蛋白表達(dá)量比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=9.998,P<0.05),實(shí)驗(yàn)組Caspase-9蛋白表達(dá)量要明顯高于陰性對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.911,P=0.027,見(jiàn)圖3)。

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，* P<0.05圖2 三組lncRNA PRNCR1基因、凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表達(dá)水平比較Figure 2 Expression levels of lncRNA PRNCR1 mRNA, Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in three groups

與其他兩組比較，* P<0.05圖3 Western blot檢測(cè)三組lncRNA PRNCR1、凋亡基因Caspase-3,Caspase-9的蛋白表達(dá)水平Figure 3 Expression levels of lncRNA PRNCR1, Caspase-3 and Caspase-9 proteins in blank control group, negative control group and experimental group by Western blot

2.4 三組腫瘤細(xì)胞的遷移能力

Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示,空白對(duì)照組中透過(guò)分子篩的細(xì)胞數(shù)為156.32 ±9.42,陰性對(duì)照組中透過(guò)分子篩的細(xì)胞數(shù)為149.12 ±8.57,實(shí)驗(yàn)組中透過(guò)分子篩的細(xì)胞數(shù)為66.81 ±7.56。三組之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.847,P=0.019 8)。其中實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.219,P=0.020 7)。

2.5 三組腫瘤細(xì)胞的凋亡水平

AV-PI檢測(cè)結(jié)果顯示,空白對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為(3.92 ±0.05)%,陰性對(duì)照組的凋亡率為(3.88 ±0.03)%,實(shí)驗(yàn)組的凋亡率為(9.12 ±0.01)%,三組比較差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.837,P=0.011 7)。實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.221,P=0.020 1)。

3 討論

惡性腫瘤作為威脅人類生存的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一,極大地危害人類的健康。因此尋求惡性腫瘤的治療靶點(diǎn)具有十分重要的研究意義[7,8]。lncRNA PRNCR1基因的表達(dá)與惡性腫瘤的侵襲性密切相關(guān)[9-11]。本研究聚焦于lncRNA PRNCR1基因在人肺癌中的表達(dá),構(gòu)建shRNA-lncRNA PRNCR1的慢病毒干擾載體,探究shRNA-lncRNA PRNCR1對(duì)肺癌增殖、侵襲和凋亡的作用機(jī)制。

Caspase-3是一種與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白酶,也被稱作“死亡蛋白”,既往研究中均將Caspase-3與細(xì)胞凋亡相聯(lián)系,作為細(xì)胞凋亡的指示分子[12-14]。Caspases是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一組存在于胞質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶,它們的一個(gè)重要共同點(diǎn)是活性位點(diǎn)都含有半胱氨酸,并特異地?cái)嚅_(kāi)天冬氨酸殘基后的肽鍵[15,16]。本研究通過(guò)RT-qPCR法檢測(cè)了shRNA-lncRNA PRNCR1的慢病毒干擾載體在肺癌細(xì)胞中凋亡基因Caspase-3和Caspase-9 mRNA水平的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組與空白載體病毒組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見(jiàn),shRNA-lncRNA PRNCR1在肺癌細(xì)胞的凋亡具有明顯的促進(jìn)作用,而這種促凋亡作用正是通過(guò)促進(jìn)Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。另外通過(guò)蛋白水平Western blot的檢測(cè)結(jié)果顯示Caspase-3蛋白中實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Caspase-9的蛋白相對(duì)表達(dá)量實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果顯示從蛋白水平上再次證實(shí)了shRNA-lncRNA PRNCR1在肺癌細(xì)胞的凋亡具有明顯的促進(jìn)作用。

另外,本研究采用Transwell的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的遷移,三組之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從結(jié)果中可以得出的結(jié)論是,shRNA lncRNA PRNCR1對(duì)肺癌細(xì)胞的遷移具有明顯抑制的作用。最后,我們利用AV-PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的凋亡,三組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從結(jié)果中可以得出的結(jié)論shRNA lncRNA PRNCR1對(duì)肺癌細(xì)胞的過(guò)度凋亡具有明顯的促進(jìn)作用。

然而本研究仍然具有一些缺點(diǎn),本研究只是初步研究shRNA lncRNA PRNCR1對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和過(guò)度凋亡具有明顯的作用,但是其具體起作用的分子生物學(xué)機(jī)制還沒(méi)完全明了,需要進(jìn)一步的研究。