劉 飛,雷 剛,劉 鵬,吳甜甜,黨永輝*

(1 西安交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院,陜西省牙頜疾病臨床研究中心,西安 710004;2 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院;*通訊作者,E-mail:psydyh@mail.xjtu.edu.cn)

大鼠慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激(unpredictable chronic mild stress,UCMS)模型由Katz的研究團(tuán)隊(duì)在20世紀(jì)80年代首次建立[1],最初的實(shí)驗(yàn)方案包括給予電擊、冷水刺激、束縛、顛倒光照周期等應(yīng)激措施,但是在隨后的一段時(shí)間內(nèi),該模型由于動(dòng)物倫理方面的考慮而應(yīng)用較少。Willner等[2]在前期的應(yīng)激方案上進(jìn)行改進(jìn),將應(yīng)激的多樣性提高,更加類似于人類抑郁癥發(fā)病的模式;增加了動(dòng)物倫理方面的考量,將應(yīng)激源調(diào)整的更加溫和。

UCMS模型可以很好地展現(xiàn)出人類抑郁癥的核心癥狀,即糖水偏好指數(shù)下降所反映的快感缺乏[3,4]。該模型在表觀效度、結(jié)構(gòu)效度和預(yù)測(cè)效度上均表現(xiàn)出較大的優(yōu)勢(shì),且其引發(fā)的行為異常可持續(xù)數(shù)周至數(shù)月,具有較好的時(shí)效性[5]。因此UCMS模型很可能是最有效的、應(yīng)用最廣泛的用來模擬焦慮和抑郁的動(dòng)物模型[6]。本課題組前期的研究結(jié)果表明,社會(huì)隔離誘發(fā)的軀體接觸性攻擊行為會(huì)使暴露于慢性應(yīng)激的社會(huì)隔離雄性小鼠的焦慮和抑郁樣行為更易于發(fā)生[7]。另外,處于不同生命階段的個(gè)體接受應(yīng)激后均會(huì)對(duì)大腦結(jié)構(gòu)、功能和行為表現(xiàn)產(chǎn)生不同程度的影響。有研究報(bào)道,人類在生命早期受到的負(fù)性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致焦慮、抑郁、人格障礙和進(jìn)食障礙等精神疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[8]。在本實(shí)驗(yàn)中,我們繼續(xù)沿用加入社會(huì)隔離和社會(huì)交往應(yīng)激的UCMS模型,并比較不同年齡階段大鼠對(duì)該模型的敏感程度,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(陜西省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),動(dòng)物合格證編號(hào)為SCXK(陜2012-003)。共購(gòu)買幼年(3周齡)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠20只,平均體質(zhì)量(60 ±5 g);成年(8周齡)SD大鼠20只,平均體質(zhì)量(210 ±10 g)。分組之前大鼠采用4只/籠群養(yǎng),經(jīng)過糖水基線篩選和剔除后分組,對(duì)照組于4只/籠群養(yǎng),UCMS組單籠單只飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫(22 ±1)℃,濕度在(60 ±5)%;日光燈采光,正常光暗周期為12 h/12 h(7:00 a.m-7:00 p.m),自由獲取食物和水,每周更換飼養(yǎng)籠及墊料。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.2017-536)。

1.2 實(shí)驗(yàn)流程

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)3 d后,進(jìn)行糖水基線測(cè)試和篩選,剔除不能獲得穩(wěn)定糖水偏好的大鼠后將所有大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(UCSM組)和對(duì)照組。隨后對(duì)UCMS組進(jìn)行連續(xù)5周的慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激。在應(yīng)激后第1，3，5周分別對(duì)所有大鼠進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)(sucrose preference test,SPT)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(force swimming test,FST)。

1.3 糖水偏好基線值測(cè)定

自環(huán)境適應(yīng)后連續(xù)的2周時(shí)間內(nèi)對(duì)所有大鼠進(jìn)行5次糖水偏好測(cè)試。具體方法如下:在測(cè)試前20 h對(duì)大鼠禁水,測(cè)試前2 h將所有大鼠進(jìn)行單籠放置。測(cè)試時(shí)在每個(gè)飼養(yǎng)籠放置雙瓶飲水,一瓶為自來水,另一瓶為1%蔗糖溶液,蔗糖溶液為現(xiàn)配現(xiàn)用。測(cè)試時(shí)間為1 h,測(cè)試前后分別稱量各瓶質(zhì)量,即1 h內(nèi)大鼠的飲水消耗量,計(jì)算糖水偏好指數(shù)[9]。糖水偏好指數(shù)=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。測(cè)試結(jié)束后恢復(fù)大鼠4只/籠群養(yǎng),并給與正常飲水。測(cè)定糖水偏好基線值的目的包括:使大鼠學(xué)習(xí)雙瓶飲水測(cè)試方法;剔除不能獲得穩(wěn)定的糖水偏好值,或天生無糖水偏好的大鼠,保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)中評(píng)估快感缺乏程度的可比性[10]。

1.4 建立大鼠UCMS模型

對(duì)UCMS組大鼠每天上、下午分別隨機(jī)給予慢性溫和應(yīng)激,處理包括:持續(xù)光照,持續(xù)黑暗,頻閃照明、晝夜顛倒、傾斜籠子,禁食、禁水、低溫、濕墊料、空籠子、夾尾、束縛等。按隨機(jī)化方法對(duì)各應(yīng)激處理排表,避免大鼠預(yù)料其出現(xiàn)而適應(yīng)[11]。

1.5 SPT

從給與大鼠應(yīng)激開始,每?jī)芍苓M(jìn)行SPT,實(shí)驗(yàn)方法見1.3。SPT測(cè)試時(shí)間為應(yīng)激開始后每單周周六上午10:00-11:00。

1.6 FST

從給與大鼠應(yīng)激開始,每?jī)芍苓M(jìn)行FST,測(cè)試時(shí)間為應(yīng)激開始后每單周周六及周日下午14:00-16:00。

大鼠FST實(shí)驗(yàn)分適應(yīng)和測(cè)試兩天進(jìn)行。適應(yīng)(第1天):將大鼠置于25 ℃的深水中強(qiáng)迫游泳15 min,取出后拭干、歸籠;測(cè)試(第2天):同樣條件下強(qiáng)迫游泳6 min,記錄大鼠的不動(dòng)時(shí)間。不動(dòng)時(shí)間是指大鼠漂浮在水中,沒有掙扎且僅能夠維持頭部位于水面以上的時(shí)間,以此判斷大鼠的抑郁樣行為[12,13]。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩選

經(jīng)過兩周糖水偏好值基線測(cè)量,剔除不能獲得穩(wěn)定的糖水偏好值或未表現(xiàn)出糖水偏好的大鼠8只。剩余32只大鼠按照既定的實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行處理和分組,每組8只大鼠。

2.2 不同年齡大鼠糖水偏好指數(shù)隨應(yīng)激時(shí)間的變化

不同年齡大鼠糖水偏好指數(shù)隨應(yīng)激時(shí)間的變化見圖1。幼年大鼠對(duì)照組和UCMS組的基線糖水偏好指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.474,P=0.634);經(jīng)過1周的應(yīng)激后,UCMS組大鼠的糖水偏好指數(shù)顯著低于對(duì)照組大鼠(t=2.192,P=0.046);在應(yīng)激3周(t=4.307,P=0.001)和5周(t=6.242,P<0.001)后,UCMS組大鼠的糖水偏好指數(shù)持續(xù)下降,與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1A)。成年大鼠對(duì)照組和UCMS組的基線糖水偏好指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.285,P=0.78);經(jīng)過1周(t=0.443,P=0.664)和3周(t=1.734,P=0.105)的應(yīng)激,UCMS組與對(duì)照組大鼠的糖水偏好指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;應(yīng)激5周后,UCMS組大鼠的糖水偏好指數(shù)顯著低于對(duì)照組(t=3.587,P=0.003,見圖1B)。

A.幼年大鼠 B.成年大鼠同一時(shí)點(diǎn)與對(duì)照組相比,* P<0.05,* * P<0.01,* * * P<0.001圖1 不同年齡大鼠糖水偏好指數(shù)隨應(yīng)激時(shí)間的變化Figure 1 Changes of sucrose consumption in different age rats after different time

將幼年對(duì)照組、幼年UCMS組、成年對(duì)照組和成年UCMS組大鼠各自在4個(gè)時(shí)點(diǎn)上的糖水偏好平均值進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,幼年UCMS組的糖水偏好平均值較其他三組顯著下降(F=19.927,P<0.001,見圖2)。成年UCMS組與對(duì)照組相比,糖水偏好指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與其他三組比較,* * * P<0.001圖2 不同年齡大鼠糖水偏好指數(shù)平均值比較Figure 2 Comparison of sucrose consumption among four groups

2.3 不同年齡大鼠FST不動(dòng)時(shí)間隨應(yīng)激時(shí)間的變化

圖3顯示不同年齡大鼠FST不動(dòng)時(shí)間隨應(yīng)激時(shí)間的變化。應(yīng)激后第1周,無論是幼年大鼠(t=0.854,P=0.408)還是成年大鼠(t=0.237,P=0.816),對(duì)照組與UCMS組在FST中的不動(dòng)時(shí)間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖3A)。應(yīng)激后第3周,幼年大鼠UCMS組的不動(dòng)時(shí)間顯著長(zhǎng)于對(duì)照組(t=3.464,P=0.006);而成年大鼠對(duì)照組和UCMS組在FST中的不動(dòng)時(shí)間比較仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.849,P=0.41,見圖3B)。應(yīng)激后第5周,幼年大鼠UCMS組的不動(dòng)時(shí)間顯著長(zhǎng)于對(duì)照組(t=3.48,P=0.004),成年大鼠UCMS組的不動(dòng)時(shí)間與對(duì)照組相比首次出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=2.207,P=0.045,見圖3C)。

將幼年對(duì)照組、幼年UCMS組、成年對(duì)照組和成年UCMS組大鼠各自在3個(gè)時(shí)點(diǎn)上的FST不動(dòng)時(shí)間平均值進(jìn)行比較。幼年UCMS組的不動(dòng)時(shí)間平均值較其他三組顯著增加(F=19.663,P<0.001，見圖4)。成年UCMS組與對(duì)照組相比,不動(dòng)時(shí)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A.應(yīng)激后第1周 B.應(yīng)激后第3周 C.應(yīng)激后第5周同年齡與對(duì)照相比,* P<0.05,* * P<0.01圖3 不同年齡大鼠FST不動(dòng)時(shí)間隨應(yīng)激時(shí)間的變化Figure 3 Changes of immobility time in different age rats after different stress time

與其他三組相比,* * * P<0.001圖4 不同年齡大鼠FST平均值比較Figure 4 Comparison of immobility time among four groups

3 討論

UCMS模型是模擬焦慮和抑郁最有效的動(dòng)物模型之一,研究者們一直對(duì)該模型中所涉及到的應(yīng)激類型、方法和倫理學(xué)考量等進(jìn)行不斷的改進(jìn)。在我們課題組的前期工作中,對(duì)文獻(xiàn)中廣泛使用的方法進(jìn)行改良,將隔離小鼠彼此軀體性攻擊作為UCMS程序的一種應(yīng)激,結(jié)果發(fā)現(xiàn)社會(huì)隔離引起的攻擊行為可以加重嚙齒類動(dòng)物因UCMS引起的快感缺乏行為和焦慮、抑郁樣行為,包括SPT中糖水偏好指數(shù)的下降、明暗箱中穿梭次數(shù)和在明箱內(nèi)停留時(shí)間的增加,以及TST和FST中不動(dòng)時(shí)間的增加[7,14]。肖玲等[15]探討了應(yīng)激時(shí)程長(zhǎng)短對(duì)體質(zhì)量為200-250 g的大鼠在UCMS模型中行為學(xué)表現(xiàn)和海馬神經(jīng)可塑性相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果顯示應(yīng)激3周后大鼠海馬中神經(jīng)元再生和神經(jīng)可塑性相關(guān)蛋白(包括CREB、BDNF及Bcl-2)及mRNA表達(dá)均下降,而應(yīng)激2周大鼠與對(duì)照組大鼠相比則未出現(xiàn)顯著的變化,提示UCMS的應(yīng)激持續(xù)時(shí)間與模型構(gòu)建效果之間存在關(guān)聯(lián)。

除了應(yīng)激之外,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自身屬性也會(huì)對(duì)UCMS的效果產(chǎn)生不同的影響。例如,大鼠和小鼠對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)不同,因此在UCMS中應(yīng)激源的強(qiáng)弱程度以及對(duì)抗抑郁藥的反應(yīng)時(shí)間和效率均存在種屬差異[16]。Xing等[17]發(fā)現(xiàn)體質(zhì)量為150-200 g的大鼠在UCMS模型中的行為學(xué)、血清中皮質(zhì)酮水平以及對(duì)文拉法辛抗抑郁效果上均存在性別特異性,雌性大鼠在同樣的應(yīng)激源中HPA軸的異常調(diào)控更為敏感,雄性大鼠對(duì)文拉法辛在緩解探索行為和快感缺乏行為的表現(xiàn)則更為理想。

另外,處于不同生命階段的個(gè)體接受應(yīng)激后均會(huì)對(duì)大腦結(jié)構(gòu)、功能和行為表現(xiàn)產(chǎn)生不同程度的影響。在Teicher等[18]的綜述中指出,在童年期遭受負(fù)性應(yīng)激(包括虐待、社會(huì)隔離、家庭暴力和目睹家庭暴力等)的兒童可能會(huì)影響杏仁核和海馬的發(fā)育,并導(dǎo)致其成年后炎癥反應(yīng)、缺血性心臟病、關(guān)節(jié)炎、代謝綜合征和癌癥的發(fā)病率均較正常組高,有45%會(huì)在成年后表現(xiàn)出不同程度和類型的精神障礙。在實(shí)驗(yàn)中,我們對(duì)不同年齡大鼠在UCMS模型中的行為學(xué)表現(xiàn)進(jìn)行比較。在SPT實(shí)驗(yàn)中,幼年組和成年組大鼠的糖水偏好基線值并無差異,而幼年組大鼠較成年組大鼠對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)速度更快,接受應(yīng)激1周后糖水偏好指數(shù)就出現(xiàn)了顯著的降低,而成年組大鼠在接受應(yīng)激后5周糖水偏好指數(shù)顯著低于對(duì)照組。為了將隨機(jī)的應(yīng)激劇烈程度造成的差異最小化,對(duì)每只大鼠所檢測(cè)4個(gè)時(shí)間的糖水偏好指數(shù)取平均值后進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)幼年UCMS組的平均糖水偏好指數(shù)顯著低于其他三組。在FST實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出同樣的趨勢(shì)和規(guī)律。因此,我們認(rèn)為,幼年期大鼠接受UCMS后,行為學(xué)改變的敏感性和反應(yīng)強(qiáng)度均高于成年期大鼠。