吳文婧,韓少山,陳 葳,李 旭,趙 樂*

(1 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,西安 710061;2 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科;3 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心;4 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院陜西省腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;*通訊作者,E-mail:zhaole2@mail.xjtu.edu.cn)

最新的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,2018年肝癌在全球的新發(fā)病例預(yù)計(jì)為84萬例,居癌癥發(fā)病率的第六位,死亡病例為78萬例,致死率居癌癥死亡率的第四位[1]。目前對(duì)肝癌的診斷主要依靠血清標(biāo)志物AFP檢測(cè)和影像學(xué)檢測(cè),部分患者確診時(shí)已到晚期,而晚期患者治療措施有限、效果不佳。為改善患者預(yù)后,亟需尋找新的肝癌早期診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白LIV-1(又稱為SLC39A6或ZIP6)在乳腺癌、前列腺癌、食道癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)[2-5],通過促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)參與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。但報(bào)道肝癌中LIV-1表達(dá)水平的研究較少[6]。本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)肝癌數(shù)據(jù)集中LIV-1的表達(dá)以及預(yù)后分析,并采用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法來驗(yàn)證LIV-1在肝癌組織中的表達(dá),以探討LIV-1基因在肝癌進(jìn)展過程中的作用,并通過啟動(dòng)子區(qū)甲基化分析來探討LIV-1基因在肝癌中表達(dá)改變的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 收集2017-01～2018-01西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治入院的23例肝癌患者手術(shù)切除的肝癌組織和癌旁組織,經(jīng)病理證實(shí)均為肝細(xì)胞肝癌?；颊呤中g(shù)前均未經(jīng)過放化療治療?；颊吣挲g36-68歲,平均年齡(52 ±12)歲。

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen,反轉(zhuǎn)錄試劑盒為PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(TaKaRa,大連)。PCR試劑為北京天為時(shí)代科技有限公司的2×Taq PCR Master Mix,DEPC為Amresco產(chǎn)品。氯仿、異丙醇和無水乙醇購(gòu)自西安化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 LIV-1基因在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中表達(dá)分析 利用UALCAN在線分析工具[7](http://ualcan.path.uab.edu/index.html)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中肝癌數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)分析。在網(wǎng)站主頁(yè)輸入目的基因LIV-1,選擇肝癌組織,獲得目的基因LIV-1在肝癌組織和正常組織中的差異表達(dá),并根據(jù)肝癌組織的不同病理分級(jí)、臨床分期分析LIV-1的表達(dá)差異。

1.2.2 生存分析 利用Kaplan Meier Plotter數(shù)據(jù)(http://kmplot.com/analysis/)中的肝癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行在線生存分析[8]。該數(shù)據(jù)來源于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)LIV-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平 取液氮保存的組織標(biāo)本100 mg于液氮中,加入1 ml Trizol研磨,按Trizol試劑使用說明提取總RNA,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃ 5 min,之后94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s進(jìn)行28個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸7 min。以GAPDH為內(nèi)參照,RT-PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳,出現(xiàn)目的大小的擴(kuò)增條帶者為表達(dá)陽(yáng)性,用凝膠成像分析儀Genetools軟件分析各擴(kuò)增條帶產(chǎn)物的灰度值,用LIV-1/GAPDH的比值表示LIV-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。PCR引物由TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Sequences of RT-PCR primers

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

UALCAN在線數(shù)據(jù)中不同組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。LIV-1在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異采用配對(duì)t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)采用SPSS19.0進(jìn)行處理,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LIV-1在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)肝癌集中的表達(dá)分析

為分析肝癌組織中LIV-1的mRNA水平,我們利用UALCAN在線分析工具對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的肝癌數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)分析。對(duì)LIV-1在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌和正常肝組織中的表達(dá)水平的分析發(fā)現(xiàn),LIV-1在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織(P<0.01,圖1A)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),LIV-1在各期別肝癌組織中的mRNA水平也明顯高于正常組織(P<0.01,圖1B),但不同分期肝癌組織中的LIV-1 mRNA水平無顯著差異(P>0.05)。此外,對(duì)不同病理分級(jí)的肝癌組織LIV-1 mRNA水平的分析結(jié)果顯示,相對(duì)于正常肝臟組織,LIV-1在不同病理分級(jí)的肝癌組織中均呈高表達(dá)(P<0.01,圖1C),但是各級(jí)別的肝癌組織中的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。

2.2 LIV-1的表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的生存分析結(jié)果

來自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中的肝癌數(shù)據(jù)集包含了364例患者的生存數(shù)據(jù),根據(jù)LIV-1表達(dá)水平的高低對(duì)患者進(jìn)行在線生存分析,結(jié)果顯示,高表達(dá)LIV-1的肝癌患者的預(yù)后顯著劣于低表達(dá)患者(P<0.001,見圖2)。

2.3 LIV-1在肝癌組織中的表達(dá)驗(yàn)證

為驗(yàn)證TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)肝癌數(shù)據(jù)集中LIV-1的表達(dá)分析結(jié)果,我們采用半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測(cè)了23例肝癌患者的腫瘤組織及癌旁組織的LIV-1 mRNA水平。逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示,LIV-1在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織,表達(dá)水平分別為0.66 ±0.30和0.45 ±0.27,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002,見圖3)。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)肝癌數(shù)據(jù)集中LIV-1 mRNA水平分析Figure 1 Analysis of LIV-1 mRNA level in liver cancer data set of TCGA database

圖2 LIV-1表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的生存分析Figure 2 Survival analysis between LIV-1 expression and prognosis in patients with liver cancer

2.4 LIV-1在肝癌中高表達(dá)的機(jī)制分析

為了探討LIV-1在肝癌中異常高表達(dá)的可能機(jī)制,我們采用生物信息學(xué)的方法對(duì)LIV-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平進(jìn)行了分析。UALCAN在線分析工具對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)肝癌數(shù)據(jù)集中LIV-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的分析結(jié)果顯示,肝癌組織中LIV-1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平低于正常肝臟組織(P=0.003,見圖4),提示肝癌組織中LIV-1水平的升高可能與其啟動(dòng)子區(qū)低甲基化有關(guān)。

圖3 RT-PCR檢測(cè)的LIV-1在肝癌組織和癌旁組織中的mRNA水平Figure 3 Expression of LIV-1 in liver cancer tissues and paired normal tissues by RT-PCR

3 討論

原發(fā)性肝癌主要包括肝細(xì)胞癌(約占75%-85%)和肝內(nèi)膽管癌(占10%-15%),以及其他少見類型。肝癌在中國(guó)的發(fā)病率和死亡率分別居第四位和第三位[9],高發(fā)病率和死亡率亟需臨床尋找新的肝癌診斷預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

我們首先采用生物信息學(xué)分析方法,發(fā)現(xiàn)LIV-1基因在肝癌組織中表達(dá)升高,并且在早期腫瘤組織中就能檢測(cè)到表達(dá)的改變,提示LIV-1可能可以作為肝癌的早期診斷標(biāo)志物。但是生物信息學(xué)分析方法具有一定局限性,缺乏相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證。因此我們進(jìn)一步在臨床組織樣本中驗(yàn)證了LIV-1基因在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于在配對(duì)的癌旁組織中的表達(dá)。此外,根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中生存數(shù)據(jù)的分析結(jié)果,LIV-1高表達(dá)可能與肝癌患者的不良預(yù)后有關(guān),因此LIV-1可以作為肝癌患者的預(yù)后指標(biāo)來指導(dǎo)臨床決策。

圖4 LIV-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平Figure 4 Promoter methylation analysis of LIV-1 gene

研究表明,LIV-1基因在多種腫瘤中均有表達(dá)。Shen等[6]在肝癌細(xì)胞HepG2中利用siRNA敲低LIV-1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)可以明顯抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和裸鼠成瘤率,并可以上調(diào)上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá),提示LIV-1可能是通過促進(jìn)EMT參與肝癌的進(jìn)展。我們前期的研究中發(fā)現(xiàn),在宮頸癌HeLa細(xì)胞中,LIV-1通過靶向MAPK介導(dǎo)的Snail和Slug的表達(dá)來參與宮頸癌細(xì)胞的侵襲,其表達(dá)下調(diào)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、克隆形成能力[5]。我們還發(fā)現(xiàn),LIV-1在宮頸癌組織中表達(dá)升高,而在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)與正常組織相比無明顯差異[10],提示LIV-1參與了宮頸癌的發(fā)生進(jìn)展,但是在子宮內(nèi)膜癌中的意義還需要進(jìn)一步研究。

LIV-1是鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員之一,也是轉(zhuǎn)錄因子STAT3的下游靶點(diǎn)[11]。Sussman等[12]開發(fā)了一種抗體-藥物復(fù)合物(SGN-LIV1A),通過結(jié)合LIV-1蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域來靶向LIV-1蛋白,用于靶向治療包括三陰性乳腺癌在內(nèi)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌。該復(fù)合物在體外實(shí)驗(yàn)和乳腺癌、宮頸癌動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都得到了很好的驗(yàn)證,證明SGN-LIV1A可能可以用于靶向治療表達(dá)LIV-1蛋白的腫瘤患者。而LIV-1在肝癌細(xì)胞中高表達(dá),為我們提供一種新思路,可能作為肝癌潛在的治療靶點(diǎn)。

通過生物信息學(xué)手段我們預(yù)測(cè)LIV-1基因在肝癌細(xì)胞中表達(dá)升高,其機(jī)制可能與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平降低有關(guān),但仍需后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平改變是調(diào)控基因表達(dá)的重要表觀遺傳學(xué)機(jī)制,甲基化水平改變?nèi)绾斡绊慙IV-1基因在肝癌以及其他腫瘤中的表達(dá)還需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述,異常高表達(dá)的LIV-1基因可能參與了肝癌的進(jìn)展,是一種預(yù)后不良的因素。LIV-1基因啟動(dòng)子區(qū)低甲基化可能導(dǎo)致了其異常高表達(dá)。