王浩南,李 康,閆 融,陳 威,孫團鶴,王 璇,朱 琨,黨誠學

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院腫瘤外科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:dangchengxue@mail.xjtu.edu.cn)

規(guī)律成簇間隔短回文重復-序列結合核酸酶系統(tǒng)(Crispr-cas9)是一種細菌和古生菌中抵御外源性病毒或質粒入侵的獲得性免疫系統(tǒng),來源于外源性病毒或質粒序列片段的導向RNA(sgRNA)可介導cas9特異性識別相應病原的DNA分子并進行雙鏈切割[1],具有制備簡單、特異性高[2]等優(yōu)點。2013年起,通過利用Crispr-cas9系統(tǒng)的這一特性,細胞基因編輯技術獲得了重大進展。

KIAA0101,也稱為增殖細胞核抗原結合因子(PCNA-F15)、NS5ATP9,是一種可能與細胞增殖、分化、遷移、凋亡、代謝及DNA損傷后修復相關的核蛋白表達基因,其在肝癌[3][4]、乳腺癌[5]、胃癌[6]、食管癌[7]、泌尿系腫瘤[8]、卵巢癌[9]、原發(fā)性肺癌[10]等多種腫瘤中過表達,最終導致患者腫瘤復發(fā)及死亡,為預后不良的重要因素。

本研究通過Crispr-cas9基因編輯技術,設計人KIAA0101基因的sgRNA序列,體外檢測其敲除效率,構建肝癌細胞KIAA0101基因敲除的穩(wěn)轉株,以研究抑制KIAA0101表達后肝癌細胞的細胞行為學改變。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑及儀器

人類肝細胞肝癌Huh-7細胞株(美國ATCC),胎牛血清(澳大利亞Ausbian),DMEM培養(yǎng)基,DMSO,胰蛋白酶(生工生物工程股份公司),Puromycin(美國Clontech),D-Hanks(上海吉凱基因),GV371慢病毒(上海吉凱基因),Giemsa染色液(上海鼎國生物),Knockout and Mutation Detection kit(吉盛醫(yī)學),DL500 DNA Marker(日本Takara),基因組DNA抽提試劑盒(中國天根),CruiserTM基因敲除檢測試劑盒(江蘇吉銳),10×DNA Loading Buffer(Sols),2×Taq Plus Master Mix(南京Vazyme),MTT Kit(美國Genview),凋亡試劑盒(美國eBioscience),熒光顯微鏡(奧林巴斯),CO2培養(yǎng)箱(日本三洋),倒置顯微鏡(上海蔡康光學儀器公司),離心機(賽默飛世爾科技有限公司),酶標儀(瑞士Tecan infinite),96孔板(中國康寧),流式細胞儀(美國Millipore)等。

1.2 制備KIAA0101基因敲除的穩(wěn)轉株

1.2.1 設計并合成Oligo DNA序列 將人KIAA0101基因序列輸入在線工具(http://tools.genome-engineering.org),篩選出3組目的sgRNA序列,擴增片段大小均為910 bp,并根據(jù)該序列設計相應Oligo序列(見表1),同時設置對照組,對照組插入序列CGCTTCCGCGGCCCGTTCAA,設計完成后送至深圳華大基因合成該序列。

表1 KIAA0101基因的sgRNA構建Table 1 The sgRNA construction of KIAA0101 gene

1.2.2 連接crispr慢病毒載體 將合成的兩條單鏈Oligo DNA退火形成雙鏈DNA,再與慢病毒載體GV371連接,退火反應體系:取上下游引物各1 μl,靶DNA 2 μl,2×Taq Plus Master Mix 25 μl,ddH2O 22 μl,退火步驟:95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 60 s:35個循環(huán);72 ℃ 5 min,95 ℃變性5 min自然冷卻。將PCR產(chǎn)物構建載體,每個靶點單克隆測序。設計兩條CruiserTM酶引物(3個靶點共用同一對引物),引物序列如下:KIAA0101-seq-F:GGTGCGGACTAAAGCAGACAG,KIAA0101-seq-R:CCTGTAATCCCAGTAGGAGGATTG,可分別將每個靶點DNA切為300-500 bp不等的序列,備用。

1.2.3 sgRNA-cas9共表達慢病毒轉染并篩選活性sgRNA 于6孔板培養(yǎng)Huh-7細胞,處于對數(shù)生長期的細胞胰酶消化,完全培養(yǎng)基制成(3-5)×104個/ml細胞懸液,繼續(xù)培養(yǎng)保證感染時鋪板量達到15%-30%左右。

使用感染液將細胞制成(3-5)×105個/ml懸液,感染后8-12 h左右,將各孔中細胞收集到干凈的1.5 ml EP管中,以2 000 r/min離心2 min,去掉上清液,更換為完全培養(yǎng)基,輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)。感染后72 h左右,熒光顯微鏡觀察報告基因的表達情況,熒光率即為陽性感染率。

有限稀釋細胞培養(yǎng)液,離心去上清,PBS清洗沉淀細胞,進行PCR檢測。PCR體系如下:上下游引物各1 μl,dNTP 1 μl,Taq酶0.5 μl,10×Taq酶buffer 5 μl,MgCl23 μl,ddH2O 33.5 μl,退火步驟:95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s:35個循環(huán);72 ℃ 5 min,95 ℃變性5 min自然冷卻。產(chǎn)物使用CruiserTM酶切15-20 min,酶切產(chǎn)物凝膠電泳,獲得混合克隆pool酶切檢測結果。將剩余的靶細胞稀釋后于96孔板單克隆培養(yǎng),取1 000個左右的細胞提取基因組,使用核酸內(nèi)切酶篩選陽性克隆。

Western blot驗證轉染后靶基因編碼蛋白表達情況。留取KIAA0101敲除成功的穩(wěn)轉株備用。

1.3 KIAA0101基因敲除的穩(wěn)轉株的細胞行為學改變

1.3.1 MTT實驗 將處于對數(shù)生長期的KIAA0101基因敲除組(KO組)和空白對照組(NC組)細胞胰酶消化后,完全培養(yǎng)基重懸成細胞懸液,并計數(shù)。于96孔板上每孔接種1 000個細胞,每組3個重復。放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鋪板后第2天開始,第7天終止,每24 h檢測一次,培養(yǎng)終止前4 h加入20 μl 5 mg/ml的MTT于孔中。振蕩器振蕩2-5 min,酶標儀490/570 nm檢測OD值。

1.3.2 細胞周期檢測 細胞生長至覆蓋率約為80%時,胰酶消化,完全培養(yǎng)基重懸成細胞懸液,收集細胞于5 ml離心管中,每組設三個復孔。1 300 r/min離心5 min,棄上清,4 ℃預冷的D-Hanks洗滌細胞沉淀1次。1 300 r/min、5 min離心,4 ℃預冷的75%乙醇固定細胞至少1 h。1 300 r/min離心5 min去固定液,D-Hanks洗滌細胞沉淀一次,根據(jù)細胞量,加入一定體積的細胞染色液(0.6-1 ml)重懸,使用流式細胞儀分析細胞所處周期。

1.3.3 細胞凋亡檢測 待細胞生長至覆蓋率約為70%時藥物誘導凋亡,胰酶消化,完全培養(yǎng)基重懸成細胞懸液,與上清細胞收集于同一5 ml離心管中,每組設3個復孔,1 300 r/min離心5 min,棄上清,4 ℃預冷的D-Hanks洗滌細胞沉淀。1×binding buffer洗滌細胞沉淀一次,1 300 r/min、3 min離心,收集細胞,200 μl 1×binding buffer重懸細胞沉淀,加入10 μl Annexin Ⅴ-APC染色,室溫避光10-15 min,流式細胞儀檢測細胞凋亡數(shù)目。

1.3.4 細胞克隆形成檢測 將處于對數(shù)生長期的各實驗組細胞胰酶消化,完全培養(yǎng)基重懸,制成細胞懸液,計數(shù)后于6孔板培養(yǎng)板中各實驗組接種1 000個細胞/孔,每個實驗組設3個復孔。將接種好的細胞于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)到14 d,實驗終止前熒光顯微鏡下對細胞克隆進行拍照,每孔加入1 ml 4%多聚甲醛,固定細胞30-60 min,PBS洗滌細胞1次,加入GIEMSA染液500 μl,染色20 min。ddH2O洗滌細胞數(shù)次,晾干,數(shù)碼相機拍照,克隆計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計分析軟件使用SPSS 22.0(IBM),兩組數(shù)據(jù)間比較使用t檢驗,以P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 KIAA0101基因的sgRNA靶點檢測

將成功感染的Huh-7細胞提取DNA后使用CruiserTM酶篩選活性sgRNA,混合克隆pool檢測結果示存在敲除成功的細胞(見圖1A),CruiserTM酶切后,sg1和sg3可檢出兩條具有活性的條帶(見圖1B),可用作下一步研究的基因敲除工具。

將膠回收產(chǎn)物與空載體連接后測序,實驗組(KO組)與對照組(NC組)基因序列進行比對(見圖2),確定sgRNA序列對目的基因編輯效率,經(jīng)計算,可以得出sg1、sg2、sg3敲除效率分別為47%,0%和61%。

2.2 細胞感染

sgRNA-cas9共表達慢病毒轉染Huh-7細胞后,熒光顯示細胞感染情況見圖3。Western blot示sgRNA病毒感染靶細胞5 d、7 d后,相比對照組,sg1及sg3組KIAA0101蛋白表達均有下調(diào),其中感染7 d后下調(diào)更為明顯。

2.3 細胞功能改變

使用crispr-cas9技術抑制KIAA0101表達后,其編碼蛋白表達率明顯下降,細胞功能試驗結果見圖4。MTT檢測示基因敲除組(KO組)與對照組相比,細胞增殖差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);流式細胞儀檢測細胞周期分布結果可知,KO組相比對照組,在G1、S以及G2/M期的細胞占細胞總數(shù)的比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);細胞克隆形成檢測KO組與對照組相比,克隆形成數(shù)目差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),提示細胞成瘤能力無顯著差異;細胞凋亡實驗結果示KO組相比對照組,細胞凋亡率明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

sg1對應測序(加深色部分為對照組序列) sg3對應測序(18個序列中有11個發(fā)生缺失突變;紅色部分示突變位點)圖2 部分目的基因測序結果Figure 2 Partial gene sequencing results

圖3 Huh-7細胞感染熒光染色(×100)及Western blot結果Figure 3 Fluorescent staining and Western blot results of Huh-7 cells after infected with sgRNA

3 討論

Crispr-cas9基因編輯技術相比目前主流的ZFN技術、TALEN技術,通過RNA與目的DNA識別,引導cas9核酸酶切割互補DNA,可高效、簡便地抑制相關基因的表達,引入缺失或插入。同時,Crispr-cas9技術本身可對人類基因進行編輯來治療相關疾病,因此可利用該技術對相關基因進行修飾,抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和分化,為晚期腫瘤的治療提供新的方向。

由于具有脫靶效應,基于軟件篩選的sgRNA位點選擇并不可靠,需要通過前期實驗及回復性驗證確定相關靶點的實際切割效率。本研究通過生物信息學篩選獲得3條sgRNA,其中,sg1、sg3組具有明顯的抑制KIAA0101基因表達的功能。通過crispr-cas9技術,研究者獲得了基于crispr-cas9技術介導的KIAA0101低表達的Huh-7肝癌細胞穩(wěn)轉株,相關結果顯示,抑制KIAA0101基因表達后,相比對照組,細胞增殖、遷移能力無顯著變化,對細胞周期影響不顯著,細胞凋亡率明顯增加。

與NC組比較,* P<0.05圖4 KIAA0101基因敲除后細胞功能改變Figure 4 Cellular function changes after KIAA0101 gene knockout

肝癌是位列我國腫瘤發(fā)病率第5位、死亡率第4位的惡性腫瘤[11],對化療和放療均不敏感,對于晚期不能切除的患者,目前僅有酪氨酸激酶受體抑制劑可用于肝癌的靶向治療。因此,進一步研究肝癌的新的靶向分子作為腫瘤標志物或藥物靶點十分重要。近年已有研究表明,KIAA0101作為增殖細胞核抗原結合因子(PCNA-F15),在原發(fā)性肝癌患者組織中高表達,并與腫瘤分期、早期復發(fā)及低5年生存率相關[12]。Liu等[3]發(fā)現(xiàn)KIAA0101具有兩種變體(variant),變體1可通過抑制p53活動阻止阿霉素介導的細胞凋亡[3],變體2可拮抗變體1,具有成為肝細胞肝癌新的靶向藥物的潛質[13]。Yan等[14]認為高表達的KIAA0101通過作用于p21通路相關,可保護細胞免受紫外線照射誘導的細胞DNA損傷,降低細胞凋亡,促進細胞增殖。趙崇山等[15]通過JC-1法檢測細胞線粒體膜電位,發(fā)現(xiàn)KIAA0101可能通過線粒體凋亡途徑[16]抑制饑餓誘導的HepG2細胞凋亡。與此同時,數(shù)項研究報道,KIAA0101基因可抑制腫瘤細胞生長并阻滯細胞周期于G1-S期[10,17],其原因可能與DNA損傷反應相關。因此,本研究中抑制KIAA0101表達后,細胞凋亡率增加可能與DNA損傷修復有關。

綜上所述,本研究通過Crispr-cas9技術,設計人KIAA0101基因的sgRNA序列,構建Huh-7肝癌細胞KIAA0101基因敲除的穩(wěn)轉株,證實抑制KIAA0101基因表達后,Huh-7細胞凋亡顯著增加,其原因可能與DNA損傷修復相關。然而細胞凋亡與多條通路相關,KIAA0101受到哪些凋亡通路影響,這些通路之間存在什么關系,仍然有待進一步實驗研究和驗證。