代 佩,高 奮,高宏偉,王 遠(yuǎn),馮高潔,白 瑞,秦衛(wèi)偉,宋曉蘇,李 虹

(山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科,太原 030001;*通訊作者,E-mail:gao55555@sina.com)

高同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[1]。HCY可以通過氧化應(yīng)激、促進(jìn)炎癥反應(yīng)、損傷內(nèi)皮細(xì)胞、抑制膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)多種機(jī)制導(dǎo)致AS,研究證實(shí)HCY可以降低ABCA1、ABCG1的表達(dá)抑制膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)[2],關(guān)于HCY與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)兩者之間相關(guān)性是本實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)。

膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport,RCT)是排出體內(nèi)多余膽固醇的主要途徑,參與RCT過程的關(guān)鍵酶三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)主要與貧脂載脂蛋白A-Ⅰ(apolipoprotein A-I,ApoA-Ⅰ)結(jié)合,目的使前體高密度脂蛋白(β-HDL)成為成熟的高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL),三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1(ATP-binding cassette transporter G1,ABCG1)則直接將膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至成熟HDL進(jìn)一步代謝,而卵磷脂膽固醇轉(zhuǎn)移酶(lecithin cholesterol transferase,LCAT)有助于新生HDL酯化成熟的HDL,且ApoA-Ⅰ是LCAT的主要生理激活劑,研究證實(shí)動(dòng)脈粥樣患者的ApoA-Ⅰ水平降低,伴隨LCAT水平也會(huì)降低,因此LCAT不僅參與HDL成熟而且全程參與膽固醇代謝[3,4]。

過氧化物酶增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor α,PPARα)和肝臟X核受體α(liver X nuclear receptor α,LXRα)參與與體內(nèi)脂質(zhì)代謝,研究證實(shí)其可通過視黃醛受體(retinoid X receptor,RXR)/LXR途徑上調(diào)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵酶ABCA1、ABCG1、ApoA-Ⅰ的表達(dá),促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn),減少脂質(zhì)聚集,因ApoA-Ⅰ是LCAT的主要生理激活劑,研究證實(shí)動(dòng)脈粥樣患者的ApoA-Ⅰ降低[5],因此本研究探討HCY是否通過PPARα-LXRα通路調(diào)節(jié)RAW264.7巨噬源性泡沫細(xì)胞ABCA1、ABCG1、LCAT的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出,促進(jìn)脂質(zhì)聚集,抑制RCT,導(dǎo)致AS。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑和儀器

與鼠單核巨噬細(xì)胞(細(xì)胞代號(hào)RAW264.7 ATCC,USA),同型半胱氨酸(北京索萊寶公司),ox-LDL(北京欣和佳源公司),DMEM培養(yǎng)基(武漢博士德生物公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所),RNA提取試劑、Trizol(北京索萊寶公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司),3H膽固醇(美國(guó)American Life Science公司)。CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司,美國(guó)),PCR儀、酶標(biāo)儀(Bio-Rad,美國(guó)),相差倒置顯微鏡(Nikon TS100),FJ22107P液體閃爍計(jì)數(shù)儀(國(guó)營(yíng)二六二廠),低溫離心機(jī)(Eppendorf公司,德國(guó))電子天平(Sartorius公司,德國(guó)),酸堿度儀PB-10(Sartorius公司,德國(guó))。

1.2 RAW264.7巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)

從液氮罐中取出凍存的RAW264.7巨噬細(xì)胞,置于25 cm2的培養(yǎng)瓶中,用DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清,1%青、鏈霉素鈉),在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),在細(xì)胞生長(zhǎng)良好的狀態(tài)下,待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶的80%-90%時(shí),用含0.25%的胰蛋白酶消化并按(1 ∶4)進(jìn)行傳代。細(xì)胞傳2-3代,取生長(zhǎng)較好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞經(jīng)消化、離心、計(jì)數(shù),每孔按1.8×106個(gè)/ml細(xì)胞接種6孔板,培養(yǎng)箱孵育12 h,,每孔再加入50 mg/L ox-LDL誘導(dǎo),同時(shí)更換DMEM培養(yǎng)基(4%胎牛血清,1%青、鏈霉素鈉)孵育24 h,油紅“O”染色觀察泡沫細(xì)胞是否誘導(dǎo)成功,誘導(dǎo)成功后的泡沫細(xì)胞給予不同濃度梯度的HCY干預(yù)24 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將RAW264.7源性泡沫細(xì)胞細(xì)胞分成5組:空白對(duì)照組(即正常的RAW264.7細(xì)胞組),0.5 mmol/L HCY組,1.0 mmol/L HCY組,2.0 mmol/L HCY組,5.0 mmol/L HCY組。

1.4 油紅染色

提前按照說明書配置油紅“O”染色液,吸去培養(yǎng)液,預(yù)冷的PBS液清洗3次細(xì)胞;4%中性甲醛固定10 min,按上述方法再次清洗;每孔加入約1.5 ml油紅“O”染色液染色30 min,熒光倒置顯微鏡下(×20)觀察是否誘導(dǎo)為泡沫細(xì)胞。

1.5 Western blot檢測(cè)PPARα、LXRα和ABCA1、ABCG1、LCAT蛋白表達(dá)水平

吸去培養(yǎng)液,用預(yù)冷PBS(pH7.4)清洗3次細(xì)胞;按100 ∶1比例加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑,刮刀刮下細(xì)胞,靜置20-30 min將裂解的蛋白裝入有標(biāo)記EP管經(jīng)超聲波粉碎機(jī)粉碎、離心(12 000g10 min 4 ℃),將上層液體(即收集的蛋白)移入另一EP管,直接用于實(shí)驗(yàn)或-80 ℃保存。用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度,根據(jù)凝膠配置試劑盒說明書進(jìn)行配膠,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用含5%含牛奶TBST封閉2 h后孵育一抗,4 ℃搖床過夜,TBST洗膜(5 min 3次),室溫?fù)u床孵育二抗2 h,再次洗膜后進(jìn)行曝光(超敏ECL法)。以目的蛋白和β-actin密度比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PPARα、LXRα和ABCA1、ABCG1、LCAT mRNA表達(dá)

不同濃度梯度HCY干預(yù)泡沫細(xì)胞后,用預(yù)冷的PBS(pH7.4)液清洗細(xì)胞3次,按照Trizol試劑說明書提取RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度,使RNA的A260/A280保持在1.9-2.1之間,按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA?；蛞镄蛄幸姳?,GAPDH為內(nèi)參。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃ 5 s、60 ℃ 40 s循環(huán)40次。運(yùn)用2-ΔΔCt進(jìn)行分析。

表1 目的基因與內(nèi)參基因的上下游引物序列Table 1 Upstream and downstream primer sequences of the target gene and the internal reference gene

1.7 液體閃爍計(jì)數(shù)法分析膽固醇流出率

將RAW264.7源性泡沫細(xì)胞用3H標(biāo)記的膽固醇負(fù)荷培養(yǎng)24 h,用PBS(pH7.4)液清洗2次,更換新的培養(yǎng)液按上述實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行,干預(yù)后的細(xì)胞用PBS(pH7.4)洗滌細(xì)胞,培養(yǎng)于25 μg/ml載脂蛋白A-Ⅰ(apolipoprotein,apoA-Ⅰ)的新鮮培養(yǎng)基6 h,用裂解液裂解細(xì)胞,通過液體閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。通過下面公式計(jì)算:膽固醇流出率=培養(yǎng)液(count/min)值÷[培養(yǎng)液(count/min)值+細(xì)胞(count/min)值]×100%。

1.8 高效液相色譜分析細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量

干預(yù)后的RAW 264.7巨噬源性泡沫細(xì)胞,按上述方法清洗細(xì)胞后,加入一定量的0.5% NaCl溶液,超聲波粉碎10 min,將裂解的液體分成兩份,一份用于提取總膽固醇,一份用于提取游離膽固醇。提取好的膽固醇通過Waters反向C18柱測(cè)量方式,流動(dòng)相為異丙醇 ∶乙腈(50 ∶50),分別以流速1 ml/min,柱溫40 ℃,將每組實(shí)驗(yàn)提取到的20 μl樣品溶液按上述色譜條件測(cè)量,記錄膽固醇的峰面積。計(jì)算總膽固醇量(total cholesterol,TC)和游離膽固醇(free cholesterol,FC)量,總膽固醇量減去游離膽固醇量為膽固醇酯(cholesteryl ester,CE)的量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 油紅“O”染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴含量

在相差倒置熒光顯微鏡20倍鏡下觀察油紅“O”染色后的細(xì)胞狀態(tài),結(jié)果是對(duì)照組未見橘黃色脂滴(見圖1A),ox-LDL誘導(dǎo)成功的RAW 264.7巨噬源性泡沫細(xì)胞經(jīng)油紅“O”染色可見含橘黃色脂滴，且隨HCY濃度梯度增加,細(xì)胞內(nèi)的脂滴數(shù)量逐漸增加(見圖1B-E)。

2.2 Western blot檢測(cè)PPARα、LXRα和ABCA1、ABCG1、LCAT蛋白表達(dá)的結(jié)果

經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)成為RAW264.7巨噬源性泡沫細(xì)胞,再給與不同濃度梯度HCY干預(yù),Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,HCY干預(yù)組與空白對(duì)照組相比較PPARα、LXRα、ABCA1、ABCG1和LCAT的蛋白表達(dá)量均降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);隨HCY濃度增加,各組HCY濃度越高,PPARα、LXRα、ABCA1、ABCG1和LCAT的蛋白表達(dá)量越低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PPARα、LXRα和ABCA1、ABCG1、LCAT mRNA表達(dá)結(jié)果

經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)成為RAW264.7巨噬源性泡沫細(xì)胞,再給與不同濃度梯度HCY干預(yù),實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,HCY干預(yù)組與空白對(duì)照組相比較PPARα、LXRα、ABCA1、ABCG1和LCAT的mRNA表達(dá)量均降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而且隨HCY濃度增加,PPARα、LXRα、ABCA1、ABCG1和LCAT的mRNA表達(dá)量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

圖1 油紅“O”染色觀察RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴含量(×20)Figure 1 Oil red “O” staining of intracellular lipid droplets in RAW264.7 macrophages (×20)

與對(duì)照組比較,aP<0.05;與5.0 mmol/L組相比較,bP<0.05;與2.0 mmol/L組相比較,cP<0.05;與1.0 mmol/L組相比較,dP<0.05;與0.5 mmol/L組相比較,eP<0.05圖2 Western blot檢測(cè)RAW264.7巨噬源性泡沫細(xì)胞中相關(guān)指標(biāo)蛋白表達(dá)Figure 2 Expression of related proteins in RAW264.7 macrophages-derived foam cells by Western blot

與對(duì)照組比較,aP<0.05;與5.0 mmol/L組相比較,bP<0.05;與2.0 mmol/L組相比較,cP<0.05;與1.0 mmol/L組相比較,dP<0.05;與0.5 mmol/L組相比較,eP<0.05圖3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)RAW264.7巨噬源性泡沫細(xì)胞中相關(guān)mRNA表達(dá)Figure 3 Expression of related mRNAs in RAW264.7 macrophages-derived foam cells by RT-PCR

2.4 液體閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出

經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)成為RAW264.7巨噬源性泡沫細(xì)胞,再給與不同濃度HCY干預(yù),液體閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率,結(jié)果表明,HCY干預(yù)組與空白對(duì)照組相比較膽固醇流出率均降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);隨HCY濃度增加,膽固醇流出率降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。

與對(duì)照組比較,aP<0.05;與5.0 mmol/L組相比較,bP<0.05;與2.0 mmol/L組相比較,cP<0.05;與1.0 mmol/L組相比較,dP<0.05;與0.5 mmol/L組相比較,eP<0.05圖4 液體閃爍計(jì)數(shù)法測(cè)RAW264.7巨噬源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出Figure 4 Determination of intracellular cholesterol efflux rate in RAW264.7 macrophages-derived foam cells by liquid scintillation counting

2.5 高效液相色譜分析細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量

經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)成為RAW264.7巨噬源性泡沫細(xì)胞,再給與不同濃度梯度HCY干預(yù),高效液相色譜檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量,結(jié)果表明,HCY干預(yù)組與空白對(duì)照組相相比較膽固醇含量均增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);隨HCY濃度增加,膽固醇含量升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

表2 高效液相色譜分析RAW264.7巨噬源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量Table 2 Analysis of intracellular cholesterol by high performance liquid chromatography

TC:總膽固醇;FC:游離膽固醇;CE:膽固醇酯;對(duì)照組比較,aP<0.05;與5.0 mmol/L組相比較,bP<0.05;與2.0 mmol/L組相比較,cP<0.05;與1.0 mmol/L組相比較,dP<0.05;與0.5 mmol/L組相比較,eP<0.05

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是冠心病的病理基礎(chǔ),脂質(zhì)代謝異常是導(dǎo)致AS的主要機(jī)制,泡沫細(xì)胞的形成是AS的起始標(biāo)志之一,如何阻斷泡沫細(xì)胞的形成仍是目前研究的重點(diǎn)[6]。

高同型半胱氨酸(HHCY)為導(dǎo)致冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,血管造影證實(shí)總HCY水平是預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈疾病死亡率的強(qiáng)有力的因子[7]。HCY通過氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、損傷內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)血栓形成及抑制膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)等多種途徑導(dǎo)致AS,.本實(shí)驗(yàn)主要研究HCY與血脂代謝及RCT之間的相關(guān)性,ABCA1、ABCG1作為ATP結(jié)盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC)家族的成員,主要參與能量和脂質(zhì)代謝[8],相關(guān)研究證實(shí)HCY可下調(diào)RCT過程中的關(guān)鍵酶如ABCA1、ABCG1的表達(dá)抑制膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn),促進(jìn)脂質(zhì)聚集[9]。RCT是以HDL為載體排出體內(nèi)多余膽固醇的主要途徑,ABCA1通過細(xì)胞表面ApoA-Ⅰ將新生盤狀HDL即不成熟HDL轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒霩DL,且ABCA1介導(dǎo)的膽固醇外流是RCT的第一步也是其限速步驟,ABCG1直接將膽固醇直接轉(zhuǎn)運(yùn)至成熟HDL進(jìn)行代謝[8]。1962年,Glomset[10]發(fā)現(xiàn)LCAT是由肝臟分泌的一種糖蛋白,體內(nèi)大約80%的膽固醇酯通過LCAT代謝,說明其在膽固醇代謝中不可缺少,體內(nèi)LCAT通過酯化作用促進(jìn)HDL的成熟而參與膽固醇的代謝,且HDL中apoA-Ⅰ是LCAT的唯一激活劑,動(dòng)脈粥樣患者體內(nèi)ApoA-Ⅰ明顯降低,會(huì)間接導(dǎo)致體內(nèi)LCAT水平降低[11]。同時(shí)研究證實(shí)LCAT還可以通過上調(diào)ABCA1和ABCG1的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)外濃度梯度間的被動(dòng)擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇等多種方式參與RCT[12]。Ly等[13]和Kunnen等[14]均證實(shí)LCAT是促進(jìn)膽固醇向肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵酶之一。因此我們提出假設(shè)HCY影響膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)直接影響LCAT的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),與空白對(duì)照組比較,HCY干預(yù)組ABCA1、ABCG1、LCAT的表達(dá)量均降低(P<0.05),細(xì)胞內(nèi)的膽固醇含量逐漸增高(P<0.05)。而且隨HCY濃度增加,ABCA1、ABCG1、LCAT的表達(dá)量逐漸降低(P<0.05),細(xì)胞內(nèi)的膽固醇含量逐漸增高(P<0.05)。因此HCY可下調(diào)ABCA1、ABCG1、LCAT表達(dá),影響膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn),導(dǎo)致脂質(zhì)聚集增加,進(jìn)而加重AS病變。

過氧化物酶增殖物激活受體α(PPARα)和肝臟X核受體α(LXRα)做為核受體超家族的成員,結(jié)合相應(yīng)配體后,再與視黃醛受體(retinoid X receptor,RXR)形成異二聚體具有活性,主要參與脂類代謝、促進(jìn)膽固醇流出[15]。Rubic等[16]研究證實(shí)活化后的PPARα可上調(diào)與HDL代謝有關(guān)的酶:ABCA1、ABCG1、apoA-Ⅰ,同時(shí)還增加脂肪酸的氧化,減少脂肪堆積。Zeng等[17]研究發(fā)現(xiàn)LXR在RCT整個(gè)過程中均發(fā)揮作用,其調(diào)節(jié)的靶基因主要包括ABC家族、Apo E等,在巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其可上調(diào)ABCA1和ABCG1的表達(dá),將膽固醇經(jīng)apoA-Ⅰ轉(zhuǎn)運(yùn)至HDL進(jìn)行代謝,同時(shí)降低泡沫細(xì)胞的形成。呂湛等[18]在研究中證實(shí)在巨噬細(xì)胞通過PPARα攝取低密度脂蛋白的過程可以促進(jìn)LXRα的釋放,同時(shí)LXRα上調(diào)ABCA1和ABCG1的表達(dá)而促進(jìn)膽固醇的流出,說明PPARα和LXRα具有協(xié)同作用,且都是通過調(diào)節(jié)ABCA1、ABCG1的表達(dá)發(fā)揮作用。因此,我們提出假設(shè)HCY通過PPARα-LXRα影響膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)果證實(shí),與空白對(duì)照組比較,HCY干預(yù)組PPARα和LXRα的表達(dá)量均降低(P<0.05),細(xì)胞內(nèi)的膽固醇含量逐漸增高(P<0.05)。而且隨HCY濃度增加,PPARα和LXRα的表達(dá)量逐漸降低(P<0.05),細(xì)胞內(nèi)的膽固醇含量逐漸增高(P<0.05)。因此HCY可通過抑制PPARα-LXRα通路下調(diào)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵酶:ABCA1、ABCG1、LCAT表達(dá),降低膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)效率,導(dǎo)致脂質(zhì)聚集增加,進(jìn)而加重AS病變。

綜上所述,HCY做為冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,HCY可通過抑制PPARα-LXRα通路下調(diào)ABCA1、ABCG1、LCAT表達(dá),影響膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn),導(dǎo)致脂質(zhì)聚集增加,明確HCY與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)之間的相關(guān)性。這不僅有助于闡明HCY致動(dòng)脈粥樣硬化的新機(jī)制,更為心血管疾病的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)提供新的思路。