林詩發(fā)

(?？谑械谌嗣襻t(yī)院麻醉科，海南 ?？?570000)

惡性腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，死亡率僅次于心腦血管疾病〔1〕。目前手術(shù)仍然是大多數(shù)實(shí)體瘤的主要治療手段，但治療效果不佳，復(fù)發(fā)率高。臨床實(shí)踐表明：與單獨(dú)使用全身麻醉劑相比，配伍局部麻醉劑可改善各種癌癥患者術(shù)后情況〔2〕。一個涉及225例前列腺切除術(shù)的研究表明：與單純?nèi)砺樽韯┫啾?，配伍硬膜外麻醉劑?fù)發(fā)率降低57%〔3〕。全身麻醉劑具有特異性細(xì)胞信號傳導(dǎo)的作用，如吸入麻醉劑氙氣可上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子——缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α，這類藥物對缺氧損傷的器官具有細(xì)胞保護(hù)作用〔4〕。相反，靜脈麻醉劑——異丙酚已被證明具有相反的作用，可抑制HIF-1α蛋白合成〔5～7〕。HIF-1α是腫瘤生長過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，已成為潛在的治療靶標(biāo)，可激活下游的基因，促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移，癌細(xì)胞利用隨后的表型反應(yīng)，不僅可在惡劣的環(huán)境中促進(jìn)自身存活，而且比周圍的健康細(xì)胞更有競爭優(yōu)勢〔8～10〕。本研究使用成熟的前列腺癌PC3細(xì)胞系，通過觀察麻醉劑誘導(dǎo)活化的HIF-1α對前列腺癌細(xì)胞生長、遷移和侵襲過程的影響，比較吸入麻醉劑異氟烷與靜脈麻醉劑異丙酚單獨(dú)和組合使用的區(qū)別。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系 人前列腺癌PC3細(xì)胞系購于American Type Culture Collection (ATCC，Manassas，VA，USA)。

1.1.2試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基(美國HyClone實(shí)驗(yàn)室)，胎牛血清(FBS，英國ThermoScientific公司)、二甲基亞砜(DMSO)脂肪乳(天津博迪化工有限公司)，HIF-1α siRNA(英國Qiagen公司)，其他試劑購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人前列腺癌PC3細(xì)胞系(源自晚期雄激素非依賴性骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌)接種到RPMI1640培養(yǎng)基(含10%熱滅活的FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素/鏈霉素)中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)基每48 h更換一次。

異氟烷處理：將PC3細(xì)胞以1×106個/ml的密度接種于30 mm2培養(yǎng)皿上，24 h后細(xì)胞融合達(dá)到80%時使用。用含有血清的新鮮RPMI1640培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，置于鼓風(fēng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并使用校準(zhǔn)流量計(jì)和蒸發(fā)器輸送所需的異氟烷(0.5%～2.0%)組分(含21%O2和5%CO2的氮?dú)?，在37℃下用所需濃度的異氟烷處理細(xì)胞2 h。取出細(xì)胞，用全培養(yǎng)基代替無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿再次放回到37℃、含有5%CO2的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱中進(jìn)一步分析；空白對照組細(xì)胞置于37℃、含有21%O2和5%CO2的氮?dú)獾呐囵B(yǎng)箱中培養(yǎng)。在異氟烷處理后的0～24 h內(nèi)不同時間點(diǎn)分析細(xì)胞。

異丙酚處理：異丙酚制劑分別溶于10%的脂肪乳、DMSO中。將PC3細(xì)胞以1×106個/ml的密度接種在30 mm2培養(yǎng)皿上。

在異丙酚形成脂質(zhì)體時，異丙酚用PC3培養(yǎng)基稀釋至0.4 mg/ml。實(shí)驗(yàn)前，異丙酚母液用PC3無血清培養(yǎng)基稀釋至所需濃度(0.5～10.0 μg/ml)。脂肪乳對照組：20%的脂肪乳用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋到使用時的最高濃度10 μg/ml；DMSO對照組：在培育細(xì)胞前，異丙酚用PC3無血清培養(yǎng)基稀釋至臨床常用濃度(1.0～4.0 μg/ml)。DMSO對照組與4.0 μg/ml異丙酚中DMSO的量(0.05%)相對應(yīng)。將含有異丙酚的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞2 h。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞并再次使用PC3細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。

異氟烷和異丙酚配伍處理時，細(xì)胞先用含異丙酚(溶在脂肪乳或DMSO中，濃度為0～10 μg/ml)的培養(yǎng)基處理，然后用2.0%異氟烷處理2 h。隨后，異丙酚培養(yǎng)基用PC3細(xì)胞培養(yǎng)基替換，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

1.2.2氯化鈷(CoCl2)介導(dǎo)的HIF-1α誘導(dǎo)培養(yǎng) 將CoCl2粉末溶解在dH2O中制備1 mmol/L CoCl2母液，母液用含異丙酚的無血清PC3細(xì)胞培養(yǎng)基(0～4 μg/ml的脂肪乳)進(jìn)一步稀釋至100 μmol/L。處理前，將PC3細(xì)胞以1×106/ml的密度接種在30 mm2培養(yǎng)皿上，用含異丙酚的CoCl2培養(yǎng)基替換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 h。處理后立即收取細(xì)胞進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)。

1.2.3缺氧HIF-1α誘導(dǎo)培養(yǎng) 將細(xì)胞置于鼓風(fēng)培養(yǎng)箱中，在37℃、含1%O2和5%CO2的氮?dú)庵信囵B(yǎng)18 h。立即收取細(xì)胞用于Western印跡試驗(yàn)。

1.2.4siRNA靶向沉默HIF-1α 根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)HIF-1α基因siRNA序列如下：正義鏈5′-GAAGAACUAUGAACAUAAATT-3′，反義鏈5′-UUUAUGUUCAUAGUUCUUCCT-3′；非siRNA靶向沉默的非特異性基因作為陰性對照，基因序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，使用脂質(zhì)體RNAi MAX(表達(dá)載體)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。PC3細(xì)胞培養(yǎng)濃度為0.4×106個/ml，并用siRNA靶向沉默的人類HIF-1α基因或20 nmol/L的脂質(zhì)體siRNA懸液緩沖劑處理。將處理后的細(xì)胞在5%CO2、37℃下培養(yǎng)6 h。PBS洗滌細(xì)胞，使用異氟烷、異丙酚、多西他賽(DTX)進(jìn)行處理后加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.5化療劑處理PC3細(xì)胞 治療前列腺癌的抗有絲分裂化療劑——DTX與異氟烷和異丙酚聯(lián)合應(yīng)用處理PC3細(xì)胞。使用異氟烷、異氟烷和異丙酚聯(lián)合處理PC3細(xì)胞24 h；異氟烷處理siRNA預(yù)處理的PC3細(xì)胞24 h。將含1 mmol/L DTX的PC3培養(yǎng)基母液稀釋至10～100 μmol/L，替代原培養(yǎng)基培養(yǎng)上述細(xì)胞24 h。

1.2.6PI3K和MEK抑制劑處理PC3細(xì)胞 將PC3細(xì)胞(1×106個/ml)接種在30 mm2培養(yǎng)皿中，用磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)選擇性抑制劑LY294002或絲裂原活化蛋白(MAPK)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)選擇性抑制劑U0126處理，在5%CO2、37℃的孵育箱中培養(yǎng)16 h。將異氟烷、異丙酚溶于無菌DMSO中，制備濃度為10 mmol/L的母液，用無血清培養(yǎng)基稀釋至50 μmol/L。麻醉劑處理后立即收取細(xì)胞用于免疫印跡試驗(yàn)。

1.2.7免疫印跡試驗(yàn) 用冰冷的PBS洗滌上述對照或處理的PC3細(xì)胞，并在細(xì)胞裂解緩沖液〔含20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L Na2-EDTA，2 mmol/L EGTA，1%Triton，2.5 mmol/L Na4P2O7，1 mmol/L β-甘油磷酸鹽，1 mmol/L Na3VO4，1 μg/ml亮抑酶肽，1 mmol/L苯基甲磺酰氟和1 mmol/L二硫蘇糖醇〕中用刮刀裂解細(xì)胞。樣品在4℃下13 000 r/min離心30 min，收集上清液。使用Bradford法測定總蛋白濃度，每個樣品蛋白提取物的含量為40 μg。將蛋白提取物以1∶3的比例加入十二烷基硫酸鈉(SDS)樣品緩沖液中，95℃加熱10 min，在凝膠(NuPAGE 4-12%Bis-Tris)上進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，將蛋白條帶放入TBST溶液(含5%的脫脂奶粉)中，室溫?fù)u床振蕩1 h，4℃密閉12 h。按照marker分子量指示剪出所需蛋白的條帶，以0.1 ml/cm2的標(biāo)準(zhǔn)加入含有一抗(鼠抗HIF-1α、兔抗Bcl-2、兔抗HIF-1β、兔抗磷酸化Akt、小鼠抗磷酸-ERK)的封閉液，室溫孵育3 h。用TBST溶液振蕩漂洗5次，每次8 min。隨后加入二抗〔辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗或兔抗〕常溫孵育1 h。內(nèi)參抗體為α-微管蛋白(Tubulin)。印跡用TBST洗滌3次，每次5 min，Tris緩沖鹽溶液(TBS)洗滌1次，然后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒檢測。采用SyngeneGeneSnap軟件的圖像處理器采集蛋白質(zhì)條帶，蛋白質(zhì)表達(dá)水平與使用GeneTools測量的條帶強(qiáng)度相對應(yīng)。數(shù)據(jù)分析選取α-微管蛋白與對照組蛋白表達(dá)水平的比值。

1.2.8免疫細(xì)胞化學(xué)試驗(yàn) 將PC3細(xì)胞在4%多聚甲醛中固定10 min，PBS漂洗2次，每次5 min，用含0.1%Triton X-100的PBS(PBS-T)透化10 min，PBS洗滌2次，每次5 min。室溫下使用10%正常山羊血清密閉培養(yǎng)1 h。在4℃下，將細(xì)胞與任意一種抗體〔兔抗HIF-1α、兔抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、鼠抗Ki-67、鼠抗細(xì)胞色素C、小鼠細(xì)胞周期蛋白D抗體、小鼠細(xì)胞周期蛋白E抗體〕密閉培養(yǎng)12 h。PBS漂洗3次，將細(xì)胞與含驢抗兔IgG的PBS-T中孵育2 h。用PBS沖洗，在4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的Vectorshield熒光培養(yǎng)基中蓋片培養(yǎng)。對于雙重標(biāo)記，本研究使用以下抗體組合：HIF-1α/VEGF、HIF-1α/Ki-67、HIF-1α/細(xì)胞周期蛋白D和HIF-1α/細(xì)胞周期蛋白E。PC3細(xì)胞先與第一主抗體孵育過夜，隨后依次為第一次級抗體、第二主抗體、第二次級抗體。使用AxioCam數(shù)碼相機(jī)(安裝在有Zeiss KS-300軟件的Olympus BX60顯微鏡上)獲得10張高倍視野(HPF)圖。HIF-1α、HIF-1α/VEGF、HIF-1α/Ki-67和細(xì)胞色素C染色用于定性分析；對于Ki-67染色，隨機(jī)選擇8個有代表性的區(qū)域，使用ImageJ1.35軟件測量Ki-67陽性細(xì)胞的平均像素強(qiáng)度。

1.2.9細(xì)胞活力測定 使用染料3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物(MTT)評估細(xì)胞活力。在基本培養(yǎng)基加入Elele L-谷氨酰胺(MEM)稀釋MTT至0.5 mg/ml。在5%CO2、37℃的孵育箱中培養(yǎng)2 h。吸去上清，加入1 ml DMSO溶解甲臜，振蕩20 min。將樣品轉(zhuǎn)移到96孔板中，使用Mrx酶標(biāo)儀 在595 nm波長處測定吸光度值，并計(jì)算抑制率。

1.2.10劃痕實(shí)驗(yàn) 當(dāng)細(xì)胞鋪滿24孔板后，用無菌槍頭(20 μl)制造沒有貼壁細(xì)胞的均勻劃痕，PBS洗2遍以除去游離及破碎細(xì)胞，加入無血清DMEM，在倒置顯微鏡下攝片并標(biāo)記此時攝片位置。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在相同的位置再次攝片。用ImageJ 1.35軟件分析拍攝照片的劃痕距離。傷口愈合定量為剩余無細(xì)胞區(qū)域平均百分比與初始傷口的面積之比〔11〕。

1.3統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，然后用GraphPad Prism進(jìn)行Student-Newman-Keuls后分析測試。

2 結(jié) 果

2.1臨床常用濃度的異氟烷持續(xù)誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)和易位 為了區(qū)分異氟烷對HIF-1α蛋白水平的影響，將PC3細(xì)胞用0.5%～2.0%異氟烷處理2 h后，分別在0、2、4、8和24 h收取細(xì)胞，并使用免疫印跡和免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：異氟烷可誘導(dǎo)HIF-1α蛋白水平顯著增加并具有時間依賴性(表1)和劑量依賴性(表2)；2.0%異氟烷可引發(fā)HIF-1α蛋白水平顯著上調(diào)，處理后4～8 h基本持平，在處理24 h后出現(xiàn)最大值(表2)。此外，用1.5%異氟烷和2.0%異氟烷處理結(jié)果表明：異氟烷誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)活化具有劑量依賴性(表2)。然而異氟烷處理后的HIF-1β蛋白質(zhì)水平與處理時間(表1)和劑量(表2)基本無關(guān)。異氟烷處理24 h后，觀察到HIF-1α從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核的明顯易位(與空白對照相比)，并作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子啟動下游基因表達(dá)，見圖1。

表1 不同時間處理異氟烷對HIF-1α、HIF-1β表達(dá)活力的影響

表2 異氟烷相對濃度對HIF-1α、HIF-1β表達(dá)活力的影響

圖1 異氟烷對HIF表達(dá)的影響(×200)

2.2異丙酚抑制由各種興奮劑誘導(dǎo)的HIF-1α活化 以臨床常用濃度的異丙酚(≤4 μg/ml)和HIF-1α誘導(dǎo)劑：缺氧、CoCl2或異氟烷進(jìn)行共干預(yù)實(shí)驗(yàn)。處理次數(shù)取決于進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。在共干預(yù)實(shí)驗(yàn)(異丙酚和缺氧或CoCl2)之后立即收取細(xì)胞；異丙酚單獨(dú)處理后在不同的時間點(diǎn)收取細(xì)胞(0～24 h)；異丙酚和異氟烷共處理后24 h立即收取細(xì)胞。為了排除異丙酚載體的影響，這些實(shí)驗(yàn)及初始對照使用DMSO和脂肪乳為對照組。與空白對照相比，缺氧可顯著增加HIF-1α蛋白水平(表3)；缺氧和異丙酚以劑量依賴性方式共處理可消除效應(yīng)(表4)。CoCl2和異丙酚共處理細(xì)胞可觀察到與缺氧和異丙酚共處理相似的結(jié)果。CoCl2誘導(dǎo)HIF-1α活化(表4)，且異丙酚抵消該作用(表4)。最重要的是，異丙酚以劑量依賴的方式消除2%異氟烷誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)，不管是用脂肪乳(表4)還是用DMSO(表3)。

2.3異丙酚和特異性HIF-1α抑制異氟烷誘導(dǎo)的VEGF上調(diào)和細(xì)胞增殖 將經(jīng)siRNA預(yù)處理的PC3細(xì)胞用2%異氟烷單獨(dú)處理2 h，再麻醉處理24 h后收取細(xì)胞；將未經(jīng)siRNA預(yù)處理的PC3細(xì)胞分別用2%異氟烷及2%異氟烷與4 μg/ml異丙酚聯(lián)合處理2 h，再麻醉處理24 h后收取細(xì)胞。三組細(xì)胞最后通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法測定HIF-1α/VEGF和HIF-1α /Ki-67水平。4 μg/ml的異丙酚可有效阻斷異氟烷誘導(dǎo)的HIF-1α、VEGF(圖2A)和Ki-67(圖2B)的相關(guān)表達(dá)，其表達(dá)有助于血管生成及標(biāo)記活性細(xì)胞增殖。特異性HIF-1α PC3細(xì)胞也觀察到類似的抑制效果，其選擇性阻斷異氟烷誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)(圖2A)。HIF-1α抑制可使VEGF(圖2A)和Ki-67水平(圖2B)均降低。

表3 缺氧和異氟烷處理對HIF-1α表達(dá)活性的影響

表4 CoCl2和異氟烷處理對HIF-1α表達(dá)活性的影響

圖2 異氟烷單獨(dú)使用、異氟烷與異丙酚聯(lián)用及siRNA經(jīng)異氟烷處理的PC3細(xì)胞對HIF-1α/VEGF和HIF-1α/Ki-67表達(dá)的影響(×200)

2.4異氟烷促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖，而異丙酚和特異性HIF-1α抑制周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖 異氟烷處理后的PC3細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D和細(xì)胞周期蛋白E的表達(dá)增加；與用異氟烷處理相比，用異丙酚或特異性HIF-1α處理抵消了這些作用。細(xì)胞活力從異氟烷處理的1.4倍(相對于空白)降低至異氟烷與異丙酚聯(lián)合處理的1.10倍。見圖3。

圖3 異氟烷單獨(dú)使用、異氟烷與異丙酚聯(lián)用及siRNA經(jīng)異氟烷處理的PC3細(xì)胞對HIF-1α、細(xì)胞周期蛋白D和細(xì)胞周期蛋白E表達(dá)的影響(×200)

2.5異丙酚和特異性HIF-1α可逆轉(zhuǎn)異氟烷誘導(dǎo)PC3細(xì)胞對化療劑DTX的抑制作用 首先將未處理的PC3細(xì)胞暴露于異氟烷和異丙酚二者聯(lián)合組及異氟烷組，將經(jīng)siRNA預(yù)處理的PC3細(xì)胞暴露于異氟烷組，隨后將上述三組細(xì)胞及未經(jīng)處理的PC3細(xì)胞用DTX處理24 h后立即用于免疫細(xì)胞分析和免疫印跡。與單獨(dú)使用DTX處理后活躍分裂細(xì)胞為(26%±2%)相比，異氟烷組的PC3細(xì)胞中抑制有絲分裂效果較差，其活躍分裂細(xì)胞為(60%±5%)；聯(lián)合組活躍分裂細(xì)胞為(18%±1%)；經(jīng)siRNA預(yù)處理的異氟烷組活躍分裂細(xì)胞為(28%±2%)。MTT結(jié)果顯示：空白組與DMSO組細(xì)胞活力分別為(1.05±0.08)、(1.01±0.05)。與單獨(dú)使用DTX 處理的PC3細(xì)胞的細(xì)胞活力為(0.13±0.01)相比，異氟烷組具有更高的增殖速率為(0.47±0.05)；其余兩組變化不大，聯(lián)合組細(xì)胞活力為(0.18±0.03)，經(jīng)siRNA預(yù)處理的異氟烷組細(xì)胞活力為(0.14±0.03)。細(xì)胞色素C濃度結(jié)果顯示：除DTX對照組外，異氟烷組細(xì)胞色素C濃度較低。Bcl-2蛋白結(jié)果顯示：異氟烷組Bcl-2蛋白過度表達(dá)；其余3組均抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，其中空白組為1.06±0.04，DTX對照組為0.47±0.06，聯(lián)合組為0.35±0.02，經(jīng)siRNA預(yù)處理的異氟烷組表達(dá)程度最低，為0.27±0.03。見圖4。

圖4 異氟烷單獨(dú)使用、異氟烷與異丙酚聯(lián)用及siRNA經(jīng)異氟烷處理的PC3細(xì)胞經(jīng)過DTX處理，對Ki-67、細(xì)胞色素C和Bcl-2蛋白表達(dá)影響(×200)

2.6磷酸化Akt而非ERK在異氟烷或異丙酚誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)改變中發(fā)揮重要作用 圖5可見，將PC3細(xì)胞用LY294002或U0126過夜處理，再分別用異氟烷、異氟烷和異丙酚聯(lián)合處理2 h。24 h后，收取細(xì)胞用于免疫印跡和HIF-1α、p-Akt和p-ERK研究。研究表明：磷酸化激酶Akt，在異氟烷誘導(dǎo)的HIF-1α過表達(dá)中起主導(dǎo)作用；與異氟烷單獨(dú)處理相比，LY294002異氟烷聯(lián)合組及異氟烷聯(lián)用異丙酚組顯著減少HIF-1α過表達(dá)；相比之下，與單獨(dú)使用異氟烷組相比，U0126聯(lián)合異氟烷組未影響HIF-1α表達(dá)。

圖5 異氟烷、異丙酚對HIF-1α、p-Akt和p-ERK表達(dá)的影響

異氟烷組與空白對照相比顯示更高含量的p-Akt；LY294002異氟烷聯(lián)合組及異氟烷聯(lián)用異丙酚組顯著減少p-Akt表達(dá)。單獨(dú)使用異氟烷有增加p-ERK的趨勢；異氟烷和異丙酚聯(lián)合組及異氟烷和U0126聯(lián)合組顯著降低p-ERK表達(dá)。為了區(qū)分異氟烷和異丙酚處理對p-Akt的作用，將PC3細(xì)胞用單獨(dú)2%異氟烷或4 μg/ml 異丙酚分別處理2 h。隨后的0，2，4，8和24 h收取蛋白樣品。結(jié)果表明：異氟烷誘導(dǎo)p-Akt具有時間依賴性；異丙酚處理后0、2 h,p-Akt顯著降低，然后恢復(fù)到正常水平，這可能是因?yàn)榇嬖谡答仚C(jī)制。從這些發(fā)現(xiàn)可以推測異丙酚通過拮抗Akt磷酸化阻止異氟烷誘導(dǎo)的HIF-1α過表達(dá)，這種抑制也可能由于ERK磷酸化減少而減少。

2.7異丙酚和HIF-1α特異性siRNA可逆轉(zhuǎn)異氟烷增強(qiáng)的PC3細(xì)胞遷移和侵襲 劃痕實(shí)數(shù)據(jù)顯示：與對照組制造劃痕24 h后相比，異氟烷組顯著加速了空隙閉合，異丙酚或特異性HIF-1α可抑制這些效應(yīng)(圖6)。

圖6 異氟烷、異丙酚、特異性HIF-1α對細(xì)胞空隙閉合的影響(×200)

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，吸入型麻醉劑異氟烷對人工培養(yǎng)的前列腺癌PC3細(xì)胞以不依賴氧的方式激活HIF-1α表達(dá)，增強(qiáng)了癌細(xì)胞增殖、遷移及耐藥性。而單獨(dú)使用靜脈麻醉劑異丙酚對PC3細(xì)胞HIF-1α表達(dá)沒有影響，且能夠抑制化學(xué)因素或異氟烷誘導(dǎo)的HIF-1α過表達(dá)。

HIF-1α與癌癥激活和疾病發(fā)展密切相關(guān)〔12〕。已經(jīng)在多種人類癌癥中發(fā)現(xiàn)其水平升高與腫瘤生長、血管形成、轉(zhuǎn)移和愈后相關(guān)〔13〕。由于轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控數(shù)百個基因表達(dá)，HIFs調(diào)節(jié)血管生成、代謝重新編程、增殖、轉(zhuǎn)移和侵入等腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵步驟，因此該治療靶標(biāo)備受關(guān)注。

本研究表明：HIF-1α從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核發(fā)揮其作為轉(zhuǎn)錄因子的作用，其下游基因的表達(dá)也隨之上升，包括VEGF和Ki-67，異氟烷處理后這兩種蛋白顯著增加。異氟烷為廣泛使用的揮發(fā)性麻醉劑，對HIF-1α的激活使腫瘤細(xì)胞增長和轉(zhuǎn)移。因此，全身麻醉劑異氟烷可能增加前列腺癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險。

腫瘤細(xì)胞的快速和不可控性生長導(dǎo)致血液供應(yīng)不足，腫瘤內(nèi)嚴(yán)重缺氧，使HIF-1α水平上調(diào)。HIF-1α可以激活參與蛋白合成的PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK途徑。通過激活胰島素、胰島素樣生長因子、表皮生長因子和白細(xì)胞介素-2等生長因子和細(xì)胞因子，增加HIF-1α蛋白的合成速率。為了確定異氟烷可通過PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK途徑誘導(dǎo)HIF-1α上調(diào)，我們使用PI3K抑制劑LY294002或者M(jìn)APK/ERK1/2抑制劑U0126處理PC3細(xì)胞，再經(jīng)過異氟烷處理，發(fā)現(xiàn) PI3K抑制劑抑制了HIF-1α上調(diào)，而MEK 1/2抑制劑沒有顯著效果。還發(fā)現(xiàn)使用LY294002處理可消除異氟烷處理后的p-Akt水平升高。因此，多細(xì)胞效應(yīng)包括HIF-1α、Akt和異氟烷提供的級聯(lián)反應(yīng)最終會促進(jìn)癌細(xì)胞存活和生長，并使抗癌耐藥性增加。

HIFs與化學(xué)抗性相關(guān)。HIF-1α調(diào)節(jié)多藥耐藥蛋白家族ABCB1和ABCG2兩種基因轉(zhuǎn)錄，其對各種細(xì)胞毒性藥物如紫杉烷、多柔比星和長春堿具有耐藥性〔14〕。筆者發(fā)現(xiàn)，異氟烷處理的PC3細(xì)胞對DTX的響應(yīng)顯著降低是由于細(xì)胞增殖率升高、活躍細(xì)胞的比例增加、細(xì)胞損傷標(biāo)記細(xì)胞色素C及抗凋亡蛋白Bcl-2的過表達(dá)減少所導(dǎo)致。當(dāng)引入HIF-1α特異性siRNA時，該抗性減弱，表明這種效應(yīng)是通過異氟烷對HIF-1α上調(diào)造成的。

異丙酚由于藥代動力學(xué)性質(zhì)良好廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐。據(jù)報道，異丙酚通過抑制肌動蛋白應(yīng)激纖維的形成和HeLa人宮頸癌細(xì)胞病灶的黏附來減弱人類癌細(xì)胞的侵襲能力，同時抑制骨肉瘤鼠模型中的肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并增強(qiáng)小鼠和人類毒性T細(xì)胞的活性〔15,16〕。

本研究數(shù)據(jù)表明，異丙酚抑制異氟烷、CoCl2、缺氧引起的HIF-1α上調(diào)；抑制異氟烷處理引起的VEGF和Ki-67升高；抑制異氟烷誘導(dǎo)產(chǎn)生的對PTX的抗藥性。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明異丙酚具有抑制癌細(xì)胞增殖、生長的性質(zhì)。異丙酚和異氟烷聯(lián)合治療減少Akt的磷酸化并抑制HIF-1α上調(diào)，可能是異丙酚通過抑制PI3K途徑和HIF-1α的生成而產(chǎn)生抗腫瘤作用；此外，異氟烷也可誘導(dǎo)p-Akt過表達(dá)，說明異氟烷可以通過引起p-AKT過表達(dá)進(jìn)一步引起腫瘤惡化，但這需要進(jìn)一步研究。

總之，在前列腺癌細(xì)胞中異氟烷通過PI3K/AKT/mTOR途徑上調(diào)HIF-1α，引起標(biāo)記物和血管生成；同時，癌細(xì)胞活性和抗藥性增加。異丙酚聯(lián)合異氟烷通過拮抗Akt磷酸化可抑制上述效應(yīng)。未來的工作應(yīng)該研究常見組合麻醉劑在多種腫瘤模型中的作用。