張英博 費(fèi)洪新

(1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2新余學(xué)院)

阿爾茨海默病(AD)是一種老年性、神經(jīng)性、退行性和進(jìn)行性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一，其發(fā)病率隨著人口老齡化而增加，可采用多奈哌齊進(jìn)行治療〔1〕。AD發(fā)生發(fā)展與血腦屏障(BBB)通透性增加有關(guān)〔2,3〕，維持BBB的基本結(jié)構(gòu)包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及周細(xì)胞，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的閉鎖小帶蛋白(ZO)-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接(TJ)的主要結(jié)構(gòu)〔4,5〕。芒柄花黃素(FMN)具有調(diào)控BBB血管內(nèi)皮細(xì)胞晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)表達(dá)、上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和促進(jìn)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子分泌等功能〔6,7〕。本研究探討FMN對(duì)AD小鼠BBB通透性和海馬ZO-1表達(dá)的影響機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康2月齡清潔級(jí)雄性昆明小鼠56只，體質(zhì)量(22±2)g，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)〔SCXK(黑)2013-012〕，常規(guī)飼養(yǎng)、給藥及給水。

1.2主要試劑 FMN(成都曼思特生物公司，16031005)；多奈哌齊(重慶植恩藥業(yè)有限公司，20141201)；β-actin(Santa Cruz Biotechnology公司，sc47778)；ZO-1(北京博奧公司，bs1329)；Aβ1～42、D-半乳糖(Sigma公司)；RNeasy@ Mini Kit(QIAGEN公司)，其他試劑由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院超微病理實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3主要儀器 TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；STW-1型腦立體定位儀(成都儀器廠)；7300型實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x(美國(guó)ABI 公司)；HMIAS型彩色分析系統(tǒng)(武漢千屏有限公司)；6100型RT-雷杜酶標(biāo)儀(美國(guó)RT公司)；-80℃冰箱(日本SANYO公司)；超凈操作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)等。

1.4動(dòng)物模型制備、實(shí)驗(yàn)分組及治療方法 昆明小鼠56只按照隨機(jī)數(shù)字表分出8只為對(duì)照組，余下48只制備AD小鼠模型。參考文獻(xiàn)〔8，9〕方法，小鼠麻醉后去除頭毛發(fā)后固定，定位海馬，雙側(cè)腦室連續(xù)注入10 μg Aβ1～42(終濃度為2 mg/ml)，留針10 min，包扎，腹腔注射D-半乳糖(終濃度為180 mg/kg)。8只造模失敗，將造模成功40只AD模型小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分模型組、多奈哌齊組、FMN高、中、低劑量組。多奈哌齊組給予多奈哌齊(1 mg/kg)灌胃；FMN高、中、低劑量組分別給予FMN 30.0、15.0、7.5 mg/kg灌胃；對(duì)照組、模型組給予生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃35 d。

1.5測(cè)定BBB通透性 參考文獻(xiàn)〔10〕方法，用腦伊文思藍(lán)(EB)含量表示BBB通透性。小鼠灌胃結(jié)束后尾靜脈注射EB(2%)，麻醉后左心室灌注生理鹽水70 ml沖洗，冰臺(tái)上取腦并記錄腦濕重，52℃恒溫烘烤72 h后記錄腦干重。將腦放于甲酰胺溶液中浸泡，45℃避光孵育72 h后勻漿，3 000 r/min離心10 min。在酶標(biāo)儀上630 nm處測(cè)定上清液吸光度值(A)并計(jì)算EB含量。腦含水量=〔(腦濕重-腦干重)/腦濕重〕×100%。EB含量=EB濃度/腦濕重(μg/g)。

1.6檢測(cè)海馬ZO-1表達(dá) 昆明小鼠灌胃給藥結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行心臟灌注甲醛，按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，包括制備腦石蠟切片、脫蠟、過(guò)氧化物酶處理、封閉、滴加抗體、顯色、復(fù)染、透明、封片等基本步驟，采用HMIAS型彩色分析系統(tǒng)計(jì)算分析海馬積分光密度值。

1.7檢測(cè)海馬ZO-1基因表達(dá) 昆明小鼠灌胃給藥結(jié)束后處死小鼠，取材小鼠海馬，按照Trizol試劑盒方法提取海馬總RNA，合成cDNA后聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。設(shè)計(jì)β-actin、ZO-1 mRNA引物：β-actin上游 5′-CGT GCG TGA CAT CAA AGA GAA-3′，下游 5′-AAC CGC TCG TTG CCA ATA GT-3′；ZO-1上游5′-GTA ACC ATT TTT GGA CCA ATA GCT G-3′，下游5′-GCC AGA GCT ACG TTG GTC AGT T-3′，引物由上海生物工程公司合成。將反應(yīng)體系配置成50 μl，50℃反應(yīng)15 min，95℃反應(yīng)15 min，94℃反應(yīng)15 s，55℃反應(yīng)45 s，40個(gè)循環(huán)，iQTM5軟件分析PCR樣本Ct值，按照公式(2-△△Ct法)計(jì)算ZO-1相對(duì)表達(dá)量。

1.8檢測(cè)海馬ZO-1表達(dá) 昆明小鼠灌胃給藥結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行心臟灌注生理鹽水后處死小鼠，取材小鼠海馬，將海馬裂解并測(cè)定蛋白濃度。蛋白經(jīng)過(guò)100℃變性5 min、分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、加一抗、加二抗、顯色、曝光等基本步驟，采用HMIAS型彩色分析系統(tǒng)，以目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值計(jì)算ZO-1相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.9統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS19.0軟件單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1BBB通透性 相較于對(duì)照組，模型組腦含水量、腦EB含量明顯增加(P<0.05)；相較于模型組，F(xiàn)MN高、中劑量組和多奈哌齊組腦含水量、腦EB含量明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組BBB通透性比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2海馬ZO-1表達(dá) 與對(duì)照組比較，模型組海馬ZO-1積分光密度值、mRNA相對(duì)表達(dá)量、蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，F(xiàn)MN高、中劑量組和多奈哌齊組海馬ZO-1積分光密度值、mRNA相對(duì)表達(dá)量、蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度明顯升高(P<0.05)，而FMN低劑量組海馬ZO-1積分光密度值、mRNA相對(duì)表達(dá)量、蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度改變不明顯(P>0.05)。見表2。

表2 各組海馬ZO-1表達(dá)

3 討 論

AD發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，可伴有BBB血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常而出現(xiàn)通透性增加和腦水腫，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示FMN高、中劑量可改善BBB血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，降低BBB通透性，減少部分水分進(jìn)入腦內(nèi)，減輕腦水腫，小鼠海馬血管內(nèi)皮細(xì)胞BBB通透性升高時(shí)伴有海馬緊密連接關(guān)鍵蛋白ZO-1表達(dá)降低，而小鼠海馬血管內(nèi)皮細(xì)胞BBB通透性降低時(shí)伴有海馬緊密連接關(guān)鍵蛋白ZO-1表達(dá)升高，本文結(jié)果表明，F(xiàn)MN高、中劑量可改善AD小鼠BBB通透性，這與降低ZO-1表達(dá)有一定關(guān)系。

綜上，F(xiàn)MN通過(guò)抑制海馬ZO-1表達(dá)來(lái)改善AD小鼠BBB通透性，這為FMN通過(guò)ZO-1信號(hào)通路來(lái)防治AD奠定了基礎(chǔ)。