劉行海 劉紅 鄭倩 劉華 買文麗

(川北醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 四川 南充 637000)

2型糖尿病(T2DM)可累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，重者可發(fā)展為癡呆〔1，2〕。糖尿病認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。近年來中草藥對(duì)糖尿病的防治作用受到廣泛關(guān)注。人工蟲草菌絲(CS)是人工發(fā)酵培養(yǎng)得到的菌絲。現(xiàn)代藥理學(xué)證明其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)有一定作用。本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)，CS具有能保護(hù)胰島細(xì)胞的作用〔3〕。本研究探討CS對(duì)T2DM大鼠認(rèn)知障礙的影響及其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1材料 CS(上海雅吉公司，蒸餾水配制：20 mg/ml)；鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司)；血糖儀(長(zhǎng)沙三諾科技公司)；血清胰島素檢測(cè)試劑盒(上海市生物制藥研究所)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物公司)；大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(美國(guó)GBD公司)；Morris水迷宮計(jì)算機(jī)圖像實(shí)時(shí)分析系統(tǒng)(成都泰盟有限公司)。

1.2T2DM大鼠模型建立 參照本實(shí)驗(yàn)室既往方法〔4〕，12周齡健康雄性清潔級(jí)Wistar大鼠50只，體質(zhì)量(195±16)g。動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(川)2013-076。動(dòng)物及飼料均由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。自由進(jìn)食飲水適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分出對(duì)照組8只，全程采用常規(guī)飼料飼養(yǎng)。其余42只采用高能飼料喂養(yǎng)4 w，空腹12 h后一次性腹腔注射STZ 25 mg/kg(STZ臨時(shí)用0.1 mol/L，pH=4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配成1%濃度)。繼續(xù)高能飼料飼養(yǎng)4 w后，采尾靜脈血測(cè)定空腹血糖(FBG)、空腹血清胰島素(FINS)，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)，以FBG>7.8 mmol/L，同時(shí)伴有ISI降低作為T2DM模型判斷標(biāo)準(zhǔn)〔5〕。34只大鼠復(fù)制成功T2DM模型，其余淘汰。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 將成功造模的34只大鼠隨機(jī)分成模型組10只，CS低劑量(CS1)組8只〔1.5 ml/(kg·d)〕、CS中劑量(CS2)組8只〔3 ml/(kg·d)〕、CS高劑量(CS3)組8只〔6 ml/(kg·d)〕。CS各劑量組每日灌胃給予CS，連續(xù)給藥4 w。模型組和對(duì)照組每日給予等量的生理鹽水灌胃。給藥期間，全部大鼠常規(guī)飼料飼養(yǎng)。

1.4Morris水迷宮測(cè)試學(xué)習(xí)記憶能力 各組給藥4 w末進(jìn)行水迷宮測(cè)試7 d(繼續(xù)給藥)。定向航行實(shí)驗(yàn)：第 1～5 天，記錄2 min內(nèi)各組逃避潛伏期(從入水到爬上對(duì)角線象限的平臺(tái)所需時(shí)間)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：第6天開始，撤去平臺(tái)，任選一入水點(diǎn)，記錄2 min內(nèi)大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間。

1.5標(biāo)本采集及指標(biāo)測(cè)定 Morris水迷宮測(cè)試完畢后，大鼠空腹12 h，然后從心臟穿刺采血制備血漿和血清標(biāo)本并于-80℃保存待測(cè)，斷髓處死,取腦組織凍存待檢。按照試劑盒說明書檢測(cè)FBG、FINS水平及海馬組織SOD活性、MDA、TNF-α含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 對(duì)照組大鼠身體狀況良好。模型組具有糖尿病典型癥狀，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少，毛發(fā)紊亂無光澤。隨著病程延長(zhǎng),除大鼠體重呈下降趨勢(shì)外,其他癥狀和體征更加明顯。各CS干預(yù)組上述情況均有不同程度改善。模型組死亡3只，CS1組死亡2只， CS2組死亡1只。

2.2各組FBG、FINS和ISI比較 與對(duì)照組相比，模型組FBG與FINS水平明顯升高，ISI明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，CS2組和CS3組FBG與FINS水平降低， ISI明顯升高 (P<0.05)。CS的作用呈劑量依賴性，見表1。

2.3各組Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)比較 與對(duì)照組比較，模型組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，在原平臺(tái)象限停留的時(shí)間明顯縮短 (P<0.05)。與模型組比較，CS3組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)；CS2、CS3組在原平臺(tái)象限停留的時(shí)間明顯增加(P<0.05 )，見表2。

2.4各組SOD活性、MDA和TNF-α含量比較 與對(duì)照組比較，模型組SOD活性明顯降低，MDA、TNF-α含量明顯增高(P<0.05)。與模型組比較，CS2組、CS3組SOD活性明顯升高，MDA、TNF-α含量明顯降低(P<0.05)，見表3。

表1 各組FBG、FINS和ISI比較

與模型組比較：1)P<0.05，下表同

表2 各組Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)比較

表3 各組SOD活性和MDA、TNF-α含量比較

3 討 論

目前對(duì)T2DM認(rèn)知功能障礙發(fā)病的確切機(jī)制尚不明了。已有研究提示，基因調(diào)控異常、炎癥狀態(tài)、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)異常、糖基化終末產(chǎn)物積累等多個(gè)因素參與了T2DM患者認(rèn)知功能障礙發(fā)生、發(fā)展全過程〔6〕。近年來，炎癥在T2DM認(rèn)知功能障礙發(fā)病中的作用越來越受到重視。炎癥可能作為多種機(jī)制的下游關(guān)鍵環(huán)節(jié)起損害作用〔7〕。Sandireddy等〔8〕報(bào)道T2DM患者體內(nèi)的高血糖可激活多種代謝途徑，如多元醇途徑、蛋白激酶C途徑、晚期糖基化終產(chǎn)物途徑和己糖胺途徑等，所有這些途徑可以直接或間接啟動(dòng)和促進(jìn)炎癥的神經(jīng)損傷。

海馬是學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵區(qū)域〔9〕。TNF-α為促炎癥細(xì)胞因子〔10〕。Jia等〔11〕研究證實(shí)，STZ誘導(dǎo)病程5 w的糖尿病大鼠記憶能力明顯受損，并伴有海馬組織中TNF-α含量升高，這可能證實(shí)TNF-α含量與糖尿病大鼠的認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CS對(duì)糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙的改善可能與降低海馬TNF-α 含量，抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

氧化應(yīng)激在糖尿病認(rèn)知障礙的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。SOD是體內(nèi)主要抗氧化酶，保護(hù)組織細(xì)胞免受氧自由基的損傷；MDA水平反映脂質(zhì)過氧化程度，其水平升高可提示組織細(xì)胞損傷〔12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，T2DM大鼠海馬組織中MDA含量增加， SOD活性降低；而CS干預(yù)后，明顯增強(qiáng)了抗氧化酶活性，減輕了海馬組織的損傷。

總之，CS能提高T2DM大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，改善認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能主要與CS降低T2DM大鼠體內(nèi)血糖，減輕腦部炎癥反應(yīng)和提高抗氧化能力有關(guān)。