代菁 詹莉 張波 劉超

(1江漢大學(xué)附屬醫(yī)院暨武漢市第六醫(yī)院，湖北 武漢 430015；2武漢市第八醫(yī)院；3天津市胸科醫(yī)院心血管病研究所)

缺血性心臟病是導(dǎo)致心房顫動(dòng)(房顫)的主要誘因，心肌缺血再灌注損傷是心肌梗死患者再灌注治療后的后遺癥，直接導(dǎo)致患者心功能下降〔1～3〕。心肌缺血再灌注損傷的誘因有多種，如心肌抑頓、微血管痙攣、內(nèi)皮細(xì)胞水腫、血栓脫落栓塞及炎癥因子作用和原位血栓形成等〔4〕。心肌缺血再灌注損傷同樣會(huì)導(dǎo)致心肌纖維化，其中心肌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要成分是心肌纖維細(xì)胞分泌的膠原纖維，對(duì)維持心臟的正常生理功能有重要作用〔5〕。在健康心臟中，腫瘤壞死因子(TNF)-α控制著心肌ECM降解與合成〔6〕。當(dāng)在缺血缺氧狀態(tài)下，機(jī)體中的EMC合成與降解會(huì)失衡，進(jìn)而使心肌間質(zhì)重構(gòu)及心肌纖維化。當(dāng)心肌發(fā)生纖維化后會(huì)對(duì)心臟功能產(chǎn)生嚴(yán)重的不良影響〔7〕。TNF-α主要在一些炎癥性疾病如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和病毒性心肌炎等中起重要作用〔8〕。同時(shí)，也是導(dǎo)致心肌功能損傷的主要原因，會(huì)導(dǎo)致心肌缺血再灌注后心肌灌流下降的主要因素，還會(huì)上調(diào)相關(guān)白細(xì)胞介素因子的表達(dá)，從而加重心肌缺血再灌注后心肌纖維化。熱休克蛋白(HSPs)細(xì)胞是在生理或病理狀態(tài)刺激下誘導(dǎo)合成的一種細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)蛋白〔9〕。在應(yīng)激狀態(tài)下，其表達(dá)水平顯著升高〔10〕。研究顯示，在缺血再灌注損傷中HSP70會(huì)異常表達(dá)，并隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而升高〔11〕。目前對(duì)HSP70與心肌缺血再灌注損傷大鼠房顫及心肌纖維化的關(guān)聯(lián)還不清楚。本研究測(cè)定大鼠心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)活性及心肌和血清TNF-α表達(dá)和心肌組織HSP70蛋白表達(dá)，探討HSP70與心肌缺血再灌注損傷大鼠房顫及心肌纖維化的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑 選取雄性健康SD大鼠48只，體重180～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。生長(zhǎng)溫度為(23±2)℃，環(huán)境濕度為45%～50%，光照時(shí)間為每天12 h，自由進(jìn)食、進(jìn)水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、缺血30 min組、再灌注60 min組和再灌注120 min組，每組12只。SOD和MDA活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；HSP70抗體和TNF-α抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自欣博盛公司。

1.2動(dòng)物模型的建立 使用20%烏拉坦(7 ml/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，采用針形電極插入四肢以觀測(cè)心電圖。將大鼠氣管切開(kāi)，打開(kāi)胸腔暴露心臟，穿過(guò)心肌淺層進(jìn)行結(jié)扎。正常對(duì)照組：穿線(xiàn)但不結(jié)扎；缺血30 min組：穿線(xiàn)并結(jié)扎，以結(jié)扎線(xiàn)以下心肌顏色變暗為標(biāo)志，證實(shí)已經(jīng)造成心肌缺血；再灌注60 min組：處理步驟同缺血30 min組，待缺血30 min后松開(kāi)結(jié)扎線(xiàn)，恢復(fù)再灌注60 min；再灌注120 min組：處理步驟同缺血30 min組，待缺血30 min后松開(kāi)結(jié)扎線(xiàn)，恢復(fù)再灌注120 min。待以上各組處理結(jié)束后，采用摘除眼球法取血備檢，同時(shí)摘取心臟備檢。

1.3心電圖監(jiān)測(cè) 在動(dòng)物模型建立的前一天開(kāi)始進(jìn)行24 h動(dòng)態(tài)心電圖監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.4心肌組織中SOD和MDA的測(cè)定 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，摘取大鼠心臟，用4℃生理鹽水進(jìn)行沖洗備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g心肌組織，加入適量生理鹽水，研磨成組織勻漿液，3 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行心肌組織SOD活性和MDA含量測(cè)定。按試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用化學(xué)擴(kuò)增法測(cè)定SOD活性，用硫代正比妥酸(TBA)法測(cè)定MDA含量。

1.5血清中TNF-α表達(dá)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集大鼠血液樣本1 ml，3 000 r/min離心20 min。取上清液保存于-80℃?zhèn)錂z。使用ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清TNF-α濃度。

1.6心肌組織中TNF-α和HSP70表達(dá)檢測(cè) 采用Western印跡法檢測(cè)心肌組織TNF-α表達(dá)。將選取的心肌組織樣本剪切為細(xì)小碎片，稱(chēng)取20 mg心肌組織，加入200 μl組織裂解液。采用組織勻漿機(jī)對(duì)心肌組織進(jìn)行勻漿，直至充分裂解。使用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。樣本上樣量為20 μg，使用10%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上。采用5%的脫脂奶粉溶液對(duì)NC膜進(jìn)行封閉后，加入1∶1 000的TNF-α和HSP70抗體4℃孵育過(guò)夜。一抗孵育結(jié)束后，使用1∶100二抗室溫孵育2 h。采用化學(xué)發(fā)光法對(duì)NC膜進(jìn)行顯色。分析目的蛋白和內(nèi)參β-actin的Western印跡條帶。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析或者重復(fù)測(cè)量的方差分析及LSD-t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組房顫持續(xù)時(shí)間 正常對(duì)照組未見(jiàn)房顫。缺血30 min組和再灌注各組房顫時(shí)間均逐漸升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組心肌組織中SOD活性 與正常對(duì)照組相比，心肌組織中SOD活性于缺血30 min開(kāi)始降低至再灌注120 min達(dá)到最低值(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3各組心肌組織中MDA含量 與正常對(duì)照組相比，心肌組織中MDA含量于缺血30 min開(kāi)始升高至再灌注120 min達(dá)到最大值(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.4各組血清中TNF-α含量的測(cè)定 與正常對(duì)照組相比，缺血30 min組血清中TNF-α表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與缺血30 min組相比，再灌注各組血清中TNF-α表達(dá)量顯著增加，至再灌注120 min達(dá)到高峰(P<0.05)，見(jiàn)表1。炎癥因子TNF-α異常升高是心肌缺血再灌注心肌纖維化可能因素之一。

表1 各組房顫持續(xù)時(shí)間、心肌組織SOD、MDA水平和血清TNF-α含量

與正常對(duì)照組相比:1)P<0.05；與缺血30 min組相比:2)P<0.05，3)P<0.01

2.5各組心肌組織中HSP70含量 與正常對(duì)照組相比，缺血30 min組心肌組織中HSP70蛋白表達(dá)顯著增加，再灌注各組與缺血30 min組相比HSP70蛋白表達(dá)也明顯增加，說(shuō)明HSP70蛋白表達(dá)會(huì)隨著心肌缺血再灌注損傷的加重而增加。見(jiàn)圖1。

圖1 各組心肌組織中HSP70表達(dá)

2.6各組心肌組織中TNF-α表達(dá) 心肌組織TNF-α在缺血再灌注各組中的表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組，這與血清中TNF-α的表達(dá)規(guī)律相同。見(jiàn)圖2。

圖2 各組心肌組織中TNF-α表達(dá)

3 討 論

再灌注損傷是缺血恢復(fù)血流灌注后心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不可逆性損傷〔12〕。機(jī)體在心肌缺血后再灌注后會(huì)釋放出大量?jī)?nèi)源性有害因子，如興奮氨基酸和氧自由基等，同時(shí)也會(huì)釋放出內(nèi)源性保護(hù)因子如HSP70等。近年來(lái)關(guān)于心肌保護(hù)方面的研究，更多關(guān)注于HSP70的內(nèi)源性保護(hù)途徑〔13〕。HSP70是組織細(xì)胞受到氧化損傷后產(chǎn)生的一種應(yīng)激蛋白。在臨床心臟外科術(shù)后和心肌缺血再灌注動(dòng)物模型都能檢測(cè)到HSP70陽(yáng)性表達(dá)，并被證實(shí)是由心肌缺血再灌注損傷導(dǎo)致的〔14〕。本研究結(jié)果提示，HSP70蛋白表達(dá)會(huì)隨著心肌缺血再灌注損傷加重而增加，具有再灌注時(shí)間依賴(lài)性，證實(shí)HSP70蛋白與心肌缺血再灌注損傷發(fā)生與發(fā)展相關(guān)。同時(shí)，本研究結(jié)果證實(shí)了HSP70隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增強(qiáng)。在心肌缺血再灌注損傷的過(guò)程中，往往會(huì)導(dǎo)致房顫〔15〕。心肌缺血再灌注損傷中，氧自由基是導(dǎo)致缺血再灌注損傷的直接原因。氧自由基產(chǎn)生會(huì)損傷心肌細(xì)胞膜、破壞心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過(guò)氧化物〔16〕。MDA是氧自由基脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，SOD是體內(nèi)清除氧自由基的主要酶系。因此，MDA可以反映氧自由基含量和脂質(zhì)過(guò)氧化程度的指標(biāo)〔17〕。SOD可以作為反映機(jī)體抗脂質(zhì)過(guò)氧化的能力。本研究說(shuō)明心肌缺血再灌注后機(jī)體產(chǎn)生了大量的氧自由基，使機(jī)體中SOD的消耗量增加，機(jī)體內(nèi)氧自由基酶性清除系統(tǒng)受到破壞，從而導(dǎo)致心肌損傷。心肌缺血再灌注大鼠心肌纖維化與TNF-α的異常高表達(dá)密切相關(guān)。在缺血再灌注后，心肌纖維化也是導(dǎo)致心功能降低的因素之一〔18〕。心肌纖維化是心肌ECM中膠原纖維過(guò)量聚積導(dǎo)致的，存在于多種心血管疾病中〔19〕。在心肌缺血再灌注時(shí)，心肌細(xì)胞會(huì)分泌過(guò)量的膠原纖維，增加心肌僵硬度，使心肌血流供應(yīng)減慢，進(jìn)一步加重心肌缺血。已有研究證實(shí)，動(dòng)物注射TNF-α后，會(huì)導(dǎo)致心臟功能障礙、心力衰竭及心肌纖維化〔20〕。本研究結(jié)果說(shuō)明炎癥因子TNF-α的異常升高是心肌缺血再灌注心肌纖維化的可能因素之一。綜上，心肌細(xì)胞內(nèi)HSP70表達(dá)水平與心肌缺血再灌注大鼠房顫及心肌纖維化相關(guān)。同時(shí)，心肌缺血再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致大鼠房顫，并通過(guò)加重炎癥反應(yīng)導(dǎo)致房顫和心肌纖維化。HSP70可作為心肌缺血再灌注損傷發(fā)展和惡化的重要標(biāo)志。