呂哲 張穎 時(shí)美娟 孟晴 宋永周

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 1耳鼻咽喉科，河北 石家莊 050000，2骨科)

腦缺血再灌注可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞缺氧、酸中毒、大量自由基蓄積及能量耗竭，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)〔1,2〕。但是持久的ERS會(huì)激活凋亡通路，細(xì)胞凋亡產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)。作為聽覺系統(tǒng)的最高級(jí)中樞，聽皮層屬于大腦皮質(zhì)的一個(gè)亞皮質(zhì)區(qū)域。在臨床工作中許多腦卒中患者會(huì)出現(xiàn)聽力缺失〔3〕。由于神經(jīng)細(xì)胞的退行性變和凋亡，很多患者會(huì)出現(xiàn)對(duì)聲音的處理、認(rèn)知力下降。在以前的研究中，腦缺血再灌注后聽力損傷研究焦點(diǎn)多數(shù)都集中于耳蝸組織學(xué)改變，而對(duì)中樞系統(tǒng)的改變則研究甚少〔4～6〕。本研究建立局灶性腦缺血再灌注模型，觀察ERS相關(guān)因子天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-12、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78在聽皮層的表達(dá)變化，探討腦缺血再灌注對(duì)ERS及其誘導(dǎo)的凋亡導(dǎo)致聽功能損害的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組 將30只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為Sham組，缺血再灌注組，每組15只，體重250 g左右，無噪聲暴露史，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.2試劑和儀器 兔多克隆抗GRP78及Caspase-12抗體(Santa Cruz公司)，2，3，5-三苯基四唑氮紅(TTC，美國Sigma公司)，TUNEL法原位檢測細(xì)胞凋亡試劑盒、免疫組化檢測試劑盒(博士德生物工程公司)，羊抗兔IgG抗體(美國Abcam公司)，聽性腦干反應(yīng)(ABR)電位儀(美國TDT公司)。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物模型制備 大鼠麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，備皮消毒后，于頸部正中行1 cm切口，鈍性分離后顯露胸鎖乳突肌，分離頸總動(dòng)脈、頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，于距頸總動(dòng)脈分叉處2 mm剪一小口，插入線拴，進(jìn)線長度為(18.5±0.5)mm。當(dāng)感到進(jìn)線有輕微阻力時(shí)停止。扎緊固定插線。阻斷60 min后輕柔拔出線栓。缺血再灌注24 h后進(jìn)行檢測并處死、取材。Sham組只分離頸部血管，不插入線栓。

1.3.2神經(jīng)功能缺損評(píng)分 采用單盲6級(jí)5分法。正常為0分，垂直提尾時(shí)對(duì)側(cè)前肢不能完全伸展為1分；2分：垂直提尾時(shí)屈曲對(duì)側(cè)前肢；3分：行走時(shí)輕度向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；4分：行走時(shí)嚴(yán)重向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；5分：不能自主行走，向?qū)?cè)跌倒。

1.3.3ABR檢測 大鼠麻醉后置于隔聲屏蔽室內(nèi)，參考、接地電極置于兩側(cè)乳突皮下，記錄電極刺入顱頂皮下。選用10 ms短純音作為誘發(fā)ABR的刺激信號(hào)，上升下降時(shí)間為5 ms，重復(fù)率21.1次/s〔7〕。從90 dB聲壓(SPL)開始， 5 dB SPL下降一檔。以Ⅲ波反應(yīng)閾作為ABR聽閾。檢測時(shí)間為造模前及造模后24 h。

1.3.4腦梗死體積測定 每組取5只大鼠，斷頭處死后，完整取出腦組織，將大腦沿冠狀面切成5片后置入TTC溶液中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育30 min。注意每5～8 min將切片翻面使兩面著色均勻。待顯色完全后放入4%多聚甲醛中固定24 h。正常組織表現(xiàn)為均勻紅色，梗死區(qū)表現(xiàn)為蒼白區(qū)。數(shù)碼單反相機(jī)拍照，圖像分析軟件測定腦梗死體積。

1.3.5聽皮層組織學(xué)改變觀察 大鼠以4%多聚甲醛快速灌注后取腦，切取聽皮層后石蠟包埋切片。后經(jīng)脫蠟，蘇木素染核，鹽酸酒精分化，伊紅復(fù)染胞質(zhì)，封片后觀察組織學(xué)改變。

1.3.6TUNEL檢測凋亡神經(jīng)細(xì)胞 將上述步驟制作的腦組織切片脫蠟至水化，0.3%過氧化物氫封閉內(nèi)源性過氧化酶活性， 加入蛋白酶K室溫孵育30 min，滴加50 μl TUNEL反應(yīng)混合液，37℃避光孵育1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，加入50 μl酶標(biāo)記抗熒光素抗體，37℃避光孵育1 h。然后加入100 μl二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物溶液，蘇木素復(fù)染，常規(guī)封片觀察。400倍光鏡下隨機(jī)取5個(gè)不重復(fù)視野觀察，計(jì)算神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3.7免疫組化法測定Caspase-12、GRP78表達(dá) 大鼠麻醉后斷頭取腦，置于4%多聚甲醛固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明后石蠟包埋切片。采用免疫組化ABC法染色，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片、鏡檢，采用Image-Pro Plus6.0軟件進(jìn)行圖像分析。

1.3.8Western印跡檢測 麻醉后迅速取梗死側(cè)聽皮層，提取蛋白并測定濃度。每孔加入80 μg總蛋白，經(jīng)電泳分離，轉(zhuǎn)膜封閉后加入Caspase-12、GRP78抗體，37℃反應(yīng)1 h。TBST洗膜，加入羊抗兔IgG抗體，37℃反應(yīng)1 h ，凝膠成像儀掃描并進(jìn)行灰度分析，計(jì)算各目的條帶相對(duì)表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)功能評(píng)分、TTC染色 Sham組行動(dòng)自如，反應(yīng)敏捷，飲食正常。缺血再灌注組大鼠食欲差，精神萎靡，出現(xiàn)對(duì)側(cè)肢體癱瘓，轉(zhuǎn)圈及不同程度的前肢屈曲等癥狀。兩組神經(jīng)功能評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明缺血再灌注后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙。Sham組TTC染色無梗死灶，缺血再灌注組則可見明顯梗死灶，兩組梗死體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1、圖1。

表1 兩組神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積、AI比較

圖1 兩組腦組織TTC染色

2.2ABR檢測 Sham組造模前反應(yīng)閾為(24.83±4.05)dB SPL，造模后為(26.40±5.25)dB SPL，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.143 8,P>0.05)。缺血再灌注組造模前為(24.88±3.80)dB SPL，造模后為(54.60±3.26)dB SPL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-23.273 5，P<0.010)。造模前兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.333 4，P>0.05)。造模后兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-17.608 3，P<0.001)。

2.3HE染色觀察 Sham組細(xì)胞形態(tài)大致正常(細(xì)胞核大而圓，核染色質(zhì)均勻清楚，核仁明顯)，僅表現(xiàn)為極少量異形細(xì)胞(細(xì)胞排列稀疏，胞核固縮碎裂，胞質(zhì)濃縮)。與Sham組相比，缺血再灌注組異形細(xì)胞數(shù)目增多(圖2)。

圖2 聽皮層神經(jīng)細(xì)胞HE染色(×200)

2.4TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡比較 TUNEL染色顯示，Sham組偶見凋亡細(xì)胞，缺血再灌注組細(xì)胞核濃縮深染，可見凋亡小體、DNA片段化，提示缺血再灌注組誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡發(fā)生。兩組AI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3，表1。

圖3 聽皮層神經(jīng)細(xì)胞TUNEL染色(×200)

2.5免疫組化染色檢測Caspase-12、GRP78表達(dá) 光鏡下觀察Caspase-12免疫組化染色結(jié)果，染色陽性細(xì)胞呈深棕色，胞質(zhì)表達(dá)為主。與Sham組比較，缺血再灌注組陽性細(xì)胞明顯增多，表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。GRP78抗原陽性細(xì)胞呈棕黃色，多數(shù)細(xì)胞形態(tài)有改變。缺血再灌注組表達(dá)較Sham組明顯上調(diào)(P<0.01)，見圖4、圖5，表2。

2.6Western印跡檢測 Sham組大鼠Caspase-12、GRP78蛋白微弱表達(dá)，條帶較弱，缺血再灌注組則表達(dá)明顯升高，兩組表達(dá)差異比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖6，表2。

圖4 聽皮層神經(jīng)細(xì)胞GRP78免疫組化染色結(jié)果(×200)

圖5 聽皮層神經(jīng)細(xì)胞Caspase-12免疫組化染色結(jié)果(×200)

圖6 Western印跡檢測GRP78和Caspase-12蛋白表達(dá)

組別免疫組化染色GRP78Caspase-12Western印跡檢測GRP78Caspase-12Sham組0.287±0.0120.271±0.0140.58±0.220.49±0.05缺血再灌注組0.618±0.0170.750±0.0392.45±0.261.65±0.11t值-35.568 8-25.848 5-12.277 2-21.466 8P值<0.001<0.001<0.001<0.001

3 討 論

腦缺血后損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，導(dǎo)致ERS，通過多種途徑導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。當(dāng)缺血再灌注損傷累及聽皮層時(shí)，聽皮層內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)發(fā)生一系列反應(yīng)而誘發(fā)ERS及細(xì)胞凋亡，最終影響聽力〔8〕。

課題組研究人員在前期工作中觀察了ERS及相關(guān)因子在全腦缺血后聽皮層的表達(dá)變化〔7,9〕，為了更進(jìn)一步貼近臨床實(shí)際，更好模擬人類大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血狀態(tài)，改進(jìn)了實(shí)驗(yàn)方法，采用了操作更簡便，創(chuàng)傷更小的局灶性缺血再灌注損傷模型。同時(shí)通過神經(jīng)評(píng)分、TTC染色和形態(tài)學(xué)觀察證實(shí)模型成功。通過ABR證實(shí)缺血再灌注后患耳出現(xiàn)了聽力損害。因此我們推測是由于缺血致聽覺中樞的神經(jīng)元損害進(jìn)而導(dǎo)致聽力受損。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)維持細(xì)胞正常功能非常重要，對(duì)各種異常刺激如氧化應(yīng)激、缺血缺氧及鈣超載等非常敏感，可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子紊亂，未正確折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白大量堆積。但時(shí)間過長或嚴(yán)重的ERS則引起細(xì)胞凋亡，因此ERS是缺血再灌注損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔10～14〕。

GRP78是ERS的經(jīng)典標(biāo)志蛋白，能夠檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)變化，正常情況下處于失活狀態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)，大量未折疊蛋白聚集，GRP78隨即被激活，促進(jìn)未折疊蛋白的正確折疊。我們發(fā)現(xiàn)在全腦缺血再灌注12 h后即有GRP78蛋白表達(dá)最多，后逐漸下降。隨著再灌注時(shí)間延長，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受到破壞，GRP78表達(dá)下降，提示缺血再灌注12 h內(nèi)對(duì)細(xì)胞內(nèi)ERS是比較合適的〔5〕。Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑誘導(dǎo)凋亡途徑特有的關(guān)鍵分子。當(dāng)ERS發(fā)生時(shí)，Caspase-12被激活，進(jìn)一步激活Caspase-9、Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔15～17〕。我們發(fā)現(xiàn)造模后聽皮層GRP78及Caspase-12蛋白表達(dá)明顯增高，提示缺血再灌注啟動(dòng)了ERS過程及下游凋亡信號(hào)分子，最終導(dǎo)致聽皮層神經(jīng)元凋亡。

因此，ERS及其介導(dǎo)的凋亡在腦局灶性缺血再灌注后聽功能損傷中發(fā)揮著重要作用，基于ERS凋亡通路的相關(guān)分子可以進(jìn)行相應(yīng)阻斷，將是未來治療伴有腦血管基礎(chǔ)疾病的突發(fā)性耳聾患者的新的研究方向。