張欣 劉鳳艷 梁建慶 杜雪洋 胡蓉 王鑫

(甘肅中醫(yī)藥大學 1附屬醫(yī)院急診科，甘肅 蘭州 730000；2附屬醫(yī)院北院； 3基礎醫(yī)學院；4中醫(yī)臨床學院；5附屬醫(yī)院腫瘤科)

心搏驟停(CA)后綜合征(PCAS) 的本質是缺血/再灌注損傷，可導致多數患者死亡或留下嚴重后遺癥。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/糖原合成酶(GSK)-3β信號通路在PCAS中發(fā)揮著非常重要的保護作用〔1〕。本實驗旨在構建兔心肺復蘇(CPR)模型，研究集束化療法對CPR后模型兔血流動力學指標及PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表達的變化，驗證PI3K/Akt/GSK-3β信號通路是否是黃芪注射液治療PCAS的可能作用靶點，闡述該藥可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1藥物和試劑 肝素(天津生化制藥有限公司，6.25 kU/ml，批號H18030914)；鹽酸腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司，1 mg/ml，批號181108)；黃芪注射液(正大青春寶藥業(yè)有限公司，每支10 ml，相當于原藥材20 g，批號1812062)；戊巴比妥鈉(上海中西藥業(yè)股份有限公司，批號WS20180920)；氨基甲酸乙酯(國藥集團化學試劑有限公司，批號20180125)?？筆I3K抗體 (ab151549)、抗Akt抗體 (ab8805)、抗GSK3-β抗體(ab68476)，購自ABCAM公司。

1.2儀器設備 DHX-300動物呼吸機、RM6240BD型多道生理信號采集處理系統(tǒng)、YP100型壓力傳感器、YPJ01型壓力換能器(成都儀器廠)；聚乙烯醫(yī)用塑料心臟導管、動脈導管(成都泰盟科技有限公司，外徑2.0 mm，內徑1.5 mm)；T形套管；家兔實驗臺；常用實驗器械一套；肛溫表；聯(lián)想微型計算機；健源注射泵(JZB-1800)；Biotek Synergy2多功能酶標儀(美國基因有限公司)；高速冷凍離心機：Multifuge IS-R(德國THERMO公司)。

1.3動物模型制備及分組〔1〕日本大耳白兔24只，體質量2.0～2.5 kg，雌雄各半，動物合格證號：SYXK(甘)2015-0003，中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所提供。實驗兔隨機分為假手術組、腎上腺素組、亞低溫組及集束化治療組，每組6只。25%烏拉坦溶液4 ml/kg麻醉動物(從兔耳緣靜脈直接注射，必要時可追加藥量)。無菌技術操作下切開氣管,T形套管插入，然后分離暴露左側頸總動脈、右側頸靜脈與左側股動脈。經左頸總動脈插入心臟導管至左心室，連接RM6240BD型多道生理信號采集處理系統(tǒng)監(jiān)測左心室血流動力學指標；左股動脈插入動脈導管，連接生理信號采集處理系統(tǒng)監(jiān)測平均動脈壓(MAP)。采用體外電擊誘發(fā)心室纖顫(室顫)動物模型，50 V交流電持續(xù)放電30 s，以監(jiān)護儀顯示MAP<20 mmHg及出現室顫波，延續(xù)3 min表示動物模型制備成功。集束化治療組術后立即開始CPR、胸外按壓(按壓頻率200次/min，按壓深度為兔胸廓前后徑的1/3)與機械通氣〔吸氧濃度(FiO2)1.00，通氣頻率45次/min，潮氣量15 ml/kg〕同時進行，并經右頸靜脈泵入腎上腺素30 μg/kg、黃芪注射液4 g/kg。復蘇2 min后若仍為室顫則給予30 J單相波電除顫，之后持續(xù)胸外按壓2 min，如仍為室顫再以同樣能量電除顫，如此反復3次為1個周期。15 min后自主循環(huán)仍未恢復視為復蘇失敗。若出現室上性自主心律、MAP≥60 mmHg并持續(xù)5 min則表示自主循環(huán)恢復(ROSC)，復蘇成功。腎上腺素組僅給予腎上腺素注射液復蘇。假手術組不進行體外電擊致顫，不實施亞低溫療法，不靜脈給予藥物。亞低溫組除不給予黃芪注射液外，其余處理同集束化治療組。整個操作程序遵循Utstein動物模型復蘇指南方案進行〔2〕。

1.4亞低溫療法的實施程序 見文獻〔3〕。

1.5檢測指標 復蘇結束后檢測左室舒張期末壓(LVEDP)、左室內壓上升/下降最大速率(±dp/dt max)、MAP及PI3K、Akt、GSK3-β蛋白。采用RM6240BD型多道生理信號采集處理系統(tǒng)于致顫前15 min和復蘇后240 min檢測LVEDP、±dp/dt max和MAP的數值。復蘇后觀察4 h，處死白兔，立即采集心肌組織，采用Western印跡法檢測PI3K、Akt、GSK3-β蛋白表達，最終結果表示為目的條帶與內參β-actin的比值。

1.6統(tǒng)計學處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗和方差分析。

2 結 果

2.1CPR前后4組血流動力學指標比較 致顫前4組血流動力學指標均無顯著差異(均P>0.05)。復蘇后，腎上腺素組、亞低溫組及集束化治療組LVEDP均比假手術組顯著上升；集束化治療組LVEDP顯著低于腎上腺素組和亞低溫組(均P<0.01);腎上腺素組、亞低溫組和集束化治療組±dp/dt max及MAP明顯低于假手術組；集束化治療組±dp/dt max及MAP顯著高于腎上腺素組及亞低溫組(均P<0.01)。見表1。

表1 CPR前后各組LVEDP、±dp/dt max、MAP比較

與假手術組相比:1)P<0.01；與腎上腺素組相比:2)P<0.01；與亞低溫組相比:3)P<0.01；表2同

2.2各組CPR后PI3K、Akt、GSK3-β水平比較 復蘇后，腎上腺素組、亞低溫組和集束化治療組PI3K、Akt、GSK3-β水平顯著低于假手術組；集束化治療組PI3K、Akt、GSK3-β水平明顯高于腎上腺素組和亞低溫組(均P<0.01)。見表2和圖1。

表2 CPR后240 min各組PI3K、Akt、GSK3-β表達比較

圖1 Western 印跡檢測各組心肌細胞PI3K、Akt、GSK3-β表達

3 討 論

PCAS是指CA后經過有效搶救，雖然達到ROSC，但由于患者CA，發(fā)生了心肌缺血，心臟恢復自主循環(huán)，進行了心肌缺血再灌注，發(fā)生了缺血/再灌注損傷，這就是PCAS 的病理生理學本質，可導致多數患者留下嚴重后遺癥或死亡〔4〕。

腎上腺素是目前臨床公認的治療PCAS的“金標準”藥物，使用腎上腺素來挽救CA患者，已有50余年歷史。腎上腺素可以提高ROSC率，但無法改善患者出院存活率。腎上腺素用于CA患者，不僅沒有改善PCAS的病理及生理過程，而且與ROSC呈負相關關系，降低了PCAS患者短期存活率或遠期存活率〔5〕。臨床醫(yī)生以物理方法將病人體溫降低到預期水平來治療疾病的方法稱之為亞低溫療法，或者叫目標性體溫管理。目前醫(yī)學界將輕中度低溫(28～35℃)稱為亞低溫。研究指出，亞低溫治療可有效抑制機體炎性反應、減慢機體新陳代謝及增強機體對缺氧的耐受能力，患者ROSC后及早采取亞低溫治療可改善CA患者腦功能及提高出院存活率〔6〕。亞低溫療法治療PCAS具有巨大的潛力。單純的黃芪注射液或黃芪的有效成分黃芪多糖、黃芪皂苷等均具有一定的改善心血管作用。黃芪注射液對心肌缺血有顯著療效，其機制與降低冠狀血管阻力，增加冠狀血流量，改善心肌供血，降低心肌耗氧量有關〔7〕。

心力衰竭大鼠腹腔注射黃芪注射液，然后測定大鼠的血流動力學指標，發(fā)現大鼠的血流動力學指標(LVEDP、±dp/dt max、MAP)明顯改善〔8〕。臨床報道，PI3K/Akt/GSK-3β 信號通路對鼠大腦缺血/再灌注損傷有修復作用〔4,5〕，可起到神經保護作用，抑制腦損傷面積擴大〔6〕。當心肌缺血/再灌注損傷時,機體內部分激酶被活化而發(fā)揮保護作用,稱之為再灌注損傷挽救激酶(RISK),其中PI3K是最重要的一種。PI3K蛋白是一種可催化磷脂酰肌醇D-3位磷酸化的脂類激酶,最早作為一種病毒癌基因產物被發(fā)現,由起催化作用的p110 亞基和起調節(jié)作用的亞基p85構成Akt作為PI3K信號通路上的重要激酶，其激活抑制了下游GSK-3β活性，而磷酸化GSK-3β又能直接與線粒體通透性轉換孔(mPTP)亞單位ANT結合，提高mPTP開放閾值，阻止mPTP開放而發(fā)揮抑制凋亡效果〔7〕。GSK-3β目前屬于保守絲氨酸/蘇氨酸激酶家族。多種藥物可以激活PI3K/Akt通路發(fā)揮抗缺血/再灌注損傷的作用，而GSK-3β是PI3K/Akt通路的作用底物,屬于Akt下游因子，激活的PI3K/Akt可促進GSK-3β磷酸化〔8,9〕。

集束化治療方法對PCAS兔心肌有一定的保護作用，其藥理作用機制與改善兔血流動力學指標的表達有關〔10〕。楊述亮等〔11〕報道，PI3K/Akt信號通路可通過調控下游的多種效應分子，從而對器官的缺血/再灌注損傷發(fā)揮保護作用，其中GSK-3β是主要效應分子。該通路在心肌細胞缺血/缺氧培養(yǎng)、心肌缺血/再灌注損傷及離體心臟心肌缺血/再灌注損傷中的保護作用已經得到驗證。集束化治療方案可明顯改善兔心功能，優(yōu)化血流動力學，調節(jié)PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的活性發(fā)揮抑制心肌缺血/再灌注損傷的作用，PI3K/Akt/GSK-3β信號通路可能會成為治療PCAS的新靶點。