陳彤 班遵浦 羅國鴻 袁立英 廖效竹

(遵義市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

腎臟缺血再灌注(I/R)損傷是引起急性腎損傷(AKI)的主要原因，常繼發(fā)于腎臟移植、腎臟腫瘤切除術(shù)、腎動脈血運重建術(shù)等，與術(shù)后短期、長期生存率負(fù)相關(guān)〔1～4〕。橙皮苷(Hesp)具有抗凋亡、抗氧化應(yīng)激等多重藥理學(xué)功效，從而在腫瘤發(fā)生、缺血性神經(jīng)元損傷、糖尿病心肌I/R損傷等多種病理過程中發(fā)揮保護(hù)功能〔5～7〕。研究證實，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)依賴性信號通路激活是Hesp發(fā)揮多種保護(hù)功能的關(guān)鍵分子機(jī)制〔8，9〕。然而，Hesp是否通過調(diào)控PI3K/AKT通路在腎臟I/R中發(fā)揮保護(hù)功能尚未闡明。本研究建立大鼠腎臟I/R損傷模型，擬觀察Hesp對I/R腎臟的影響及其可能的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料 實驗動物：SD雄性大鼠(180～200 g，SPF級)由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。試劑與儀器：Hesp(純度>98%)與羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PI3K/AKT通路抑制劑(LY294002)購自美國Sigma公司；RNA引物、提取、反轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增試劑盒購于TaKaRa公司；Bax、Bcl-2、活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved caspase)-3/9抗體購于Abcam公司；磷酸化(p)-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購于Santa Cruz生物技術(shù)公司；超氧化物歧化酶(SOD)/丙二醛(MDA)分析試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒與電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購自武漢碧云天生物技術(shù)研究所；TUNEL凋亡試劑盒購置Roche公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗由武漢三鷹生物技術(shù)提供。

1.2腎臟I/R損傷模型構(gòu)建 參考文獻(xiàn)〔10〕方法構(gòu)建大鼠腎臟I/R損傷模型。1% 戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹正中切口后逐層分離腹膜暴露腎臟。鈍性分離右側(cè)輸尿管并用5-0絲線結(jié)扎，結(jié)扎右側(cè)腎蒂后取下右腎，腹腔內(nèi)補充肝素(40 μl)抗凝。分離左側(cè)腎臟后動脈夾夾閉左側(cè)腎蒂誘導(dǎo)腎臟缺血，腎臟由鮮紅色轉(zhuǎn)為紫黑色代表缺血成功。缺血45 min后，松開動脈夾以恢復(fù)血流供應(yīng)，腎臟由紫黑色轉(zhuǎn)為鮮紅色代表再灌注成功。再灌注24 h后，留取血液和腎臟標(biāo)本進(jìn)行下一步檢測。假手術(shù)(SO)組大鼠除左側(cè)腎蒂不夾閉外，其他處理方法同腎臟I/R(I/R)組。

1.3實驗分組 SD大鼠隨機(jī)分為3組(n=6)：SO組、I/R組和腎臟I/R+Hesp處理(I/R+Hesp)組。I/R+Hesp組在腎臟I/R術(shù)前連續(xù)3 d給予Hesp(200 mg/kg，溶于0.5% CMC-Na溶液)灌胃處理〔8〕；SO組與I/R組大鼠給予同等劑量0.5% CMC-Na。根據(jù)分組情況按上述方法構(gòu)建腎臟I/R損傷模型。實驗處理完成后，留取血液和腎臟組織標(biāo)本進(jìn)行病理及分子生物學(xué)檢測等。為進(jìn)一步探討Hesp抑制腎臟I/R損傷的具體分子機(jī)制，給予LY294002(0.3 mg/kg)進(jìn)行干預(yù)。SD大鼠隨機(jī)分為4組(n=6)：I/R組；I/R+Hesp組；I/R+LY294002組；I/R+Hesp+LY294002組。根據(jù)分組情況，按上述方法給予Hesp預(yù)處理；I/R術(shù)前30 min 給予LY294002尾靜脈注射。

1.4血清肌酐(Cr)與尿素氮(BUN)含量測定 參考文獻(xiàn)〔1，2〕方法檢測腎臟I/R損傷血清Cr與BUN含量。收集1 ml 血液標(biāo)本，室溫靜置2 h后4℃離心10 min (3 500 r/min)。收取上清液后全自動生化檢測儀(Dimension RXL Max，Siemens，Germany)檢測Cr與BUN含量。

1.5蘇木素-伊紅(HE)與TUNEL染色 參考文獻(xiàn)〔4〕方法，各組大鼠I/R左腎組織石蠟切片(厚度4 μm)，行常規(guī)HE染色，隨機(jī)選取10個視野沿皮質(zhì)到髓質(zhì)方向在光學(xué)顯微鏡觀察并拍片(400倍)，并根據(jù)腎小管上皮腫脹、間質(zhì)水腫、小管間出血等損傷程度進(jìn)行評分(0～4分)：0分，損傷范圍<10%；1分，損傷范圍10%～25%；2分，損傷范圍26%～50%；3分，損傷范圍51%～75%；4分，損傷范圍>75%。此外，TUNEL染色按試劑盒操作說明進(jìn)行，胞核黃染為陽性著色，凋亡指數(shù)=(陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.6MDA含量與SOD活性測定 參考文獻(xiàn)〔1～3〕方法檢測MDA含量及SOD酶活性。新鮮留取的腎臟標(biāo)本勻漿、4℃離心10 min(3 500 r/min)后，收集上清液分別采用硫代巴比妥法(TBA)測定MDA含量、黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，分別在450 nm、530 nm波長處測定吸光度，計算SOD活性及MDA含量。

1.7Western印跡檢測 參考文獻(xiàn)〔1～4〕方法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)情況。取-80℃保存的腎臟組織，提取總蛋白并用BCA試劑盒測定蛋白濃度，10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，用Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3/9、p-PI3K、PI3K、AKT、p-AKT及GAPDH一抗4℃孵育過夜，二抗室溫繼續(xù)孵育1 h。ECL試劑盒顯色，Image Lab軟件分析目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1Hesp改善I/R誘導(dǎo)的腎臟損傷 與SO組相比，I/R組Cr與BUN含量顯著升高(P<0.05)；與I/R組比較，I/R+Hesp組Cr、BUN水平明顯降低(P<0.05)。HE染色顯示I/R組腎小管上皮細(xì)胞壞死分離、基底膜暴露、間質(zhì)充血及炎癥細(xì)胞浸潤，且與SO組比較病理損傷評分明顯升高(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組Cr、BUN及腎小管損傷評分比較

與SO組相比：1)P<0.05；與I/R組相比：2)P<0.05；表2、3同

2.2Hesp抑制I/R誘導(dǎo)的凋亡與氧化應(yīng)激反應(yīng) 與SO組相比，I/R組Bax、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2表達(dá)顯著降低(P<0.05)，凋亡率顯著上調(diào)(P<0.05)，SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高(P<0.05)。與I/R組比較，I/R+Hesp組Bax、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，凋亡率顯著降低，SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低(P<0.05)。見表2、表3、圖2、圖3。

2.3Hesp在腎臟I/R損傷中激活PI3K/AKT信號通路 與SO組相比，I/R組p-PI3K與p-AKT表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與I/R組比較，I/R+Hesp組p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表3、圖4。

2.4LY294002逆轉(zhuǎn)Hesp對I/R腎臟的保護(hù)作用 與I/R組比較，I/R+Hesp組Cr、BUN蛋白表達(dá)及腎小管損傷評分均顯著降低(P<0.05)。與I/R+Hesp組相比，I/R+Hesp+LY294002組血清Cr、BUN含量均明顯升高并伴隨腎小管損傷評分顯著升高(P<0.05)。I/R+LY294002組與I/R+Hesp+LY294002組Cr、BUN含量及腎小管損傷評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表2 各組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

表3 各組p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)及凋亡率比較

圖2 各組TUNEL染色圖(×400)

圖3 Western印跡檢測Bax、Bcl-2、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

圖4 Western印跡檢測p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)

組別Cr(μmol/L)BUN(mmol/L)腎小管損傷評分(分)I/R組141.2±4.219.2±0.93.13±0.1I/R+Hesp組82.3±2.61)11.3±0.81)1.35±0.211)I/R+ LY294002組139.2±5.32)19.7±0.72)3.16±0.422)I/R+ Hesp +LY294002組140.1±5.12)19.8±1.92)3.13±0.052)

與I/R組相比：1)P<0.05；與I/R+Hesp組相比：2)P<0.05

3 討 論

本研究結(jié)果表明，Hesp能夠顯著抑制I/R誘導(dǎo)的腎臟功能障礙及病理損傷，并在凋亡、氧化應(yīng)激關(guān)鍵病理生理環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。Hesp促進(jìn)I/R腎臟PI3K/AKT信號通路激活，而抑制PI3K/AKT可逆轉(zhuǎn)Hesp的腎臟保護(hù)功能。以上結(jié)果表明，Hesp主要通過PI3K/AKT依賴性途徑在腎臟I/R凋亡與氧化應(yīng)激關(guān)鍵致病環(huán)節(jié)發(fā)揮保護(hù)功能。

近年來，Hesp在I/R損傷中的保護(hù)作用日益得到關(guān)注，針對其有效干預(yù)時間探討也持續(xù)進(jìn)展〔5～7〕。Gandhi等〔11〕在心肌I/R損傷中研究發(fā)現(xiàn)：Hesp預(yù)處理(15 d)能夠顯著降低心肌梗死面積。在Hesp對糖尿病心肌I/R損傷的干預(yù)實驗中觀察到，連續(xù)2 w Hesp預(yù)處理可以減輕糖尿病心臟I/R損傷，減小心肌梗死面積〔6〕。Li等〔8〕進(jìn)一步觀察了短期(3 d)Hesp預(yù)處理對心肌I/R損傷的影響，發(fā)現(xiàn)其能夠改善心臟病理損傷，抑制炎癥、凋亡與氧化應(yīng)激等多重致病環(huán)節(jié)。然而，Hesp對腎臟I/R損傷是否有保護(hù)功能尚無相關(guān)研究佐證。與以上研究結(jié)果一致，本研究在腎臟I/R損傷中觀察到Hesp(3 d)預(yù)處理對腎臟功能、結(jié)構(gòu)及凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)具有明顯的干預(yù)作用。因此，結(jié)合既往研究證據(jù)，短期或長期Hesp處理對I/R損傷具有顯著療效，同時本研究也進(jìn)一步拓展了Hesp的藥理學(xué)功效，為臨床防治腎臟I/R損傷提供了理論依據(jù)和有效的策略。

腎臟I/R損傷的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，凋亡級聯(lián)及氧化反應(yīng)過度激活是其主要病理生理改變。其中，前者以促凋亡分子Bax、凋亡執(zhí)行蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3上調(diào)并伴隨抗凋亡分子Bcl-2表達(dá)下調(diào)為主要表現(xiàn)，而氧化應(yīng)激反應(yīng)中抗氧化應(yīng)激酶SOD活性降低并伴隨氧化應(yīng)激代謝產(chǎn)物MDA含量上調(diào)〔1～4〕。既往研究表明，PI3K/AKT信號通路激活是腎臟I/R損傷中的關(guān)鍵內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，其主要通過影響下游多重效應(yīng)分子〔如血紅素氧合酶(HO)-1、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf)2等〕調(diào)控凋亡、氧化應(yīng)激等主要病理損傷過程〔10，12〕。Liu等〔2〕研究發(fā)現(xiàn)，Kappa型阿片受體(KOR)介導(dǎo)的PI3K/AKT/eNOS激活能夠有效減輕I/R誘導(dǎo)的凋亡與氧化應(yīng)激反應(yīng)，且其腎臟保護(hù)功能可以被PI3K/AKT抑制劑顯著逆轉(zhuǎn)。Zhang等〔12〕在腎臟I/R損傷中證實，Tempol 誘導(dǎo)PI3K/AKT/Nrf2信號通路激活能夠抑制cleaved caspase-3表達(dá)，并調(diào)控SOD/MDA改變，從而減輕凋亡與氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。以上結(jié)果表明，選擇性干預(yù)PI3K/AKT依賴性途徑是防治腎臟I/R的有效途徑。值得注意的是，Hesp具有激活PI3K/AKT通路的藥理活性，并構(gòu)成抑制I/R或缺氧復(fù)氧損傷的主要分子機(jī)制〔9〕。基于以上研究結(jié)果，本研究猜測Hesp也可能通過PI3K/AKT依賴性途徑在腎臟I/R中發(fā)揮保護(hù)功能。本研究結(jié)果表明，I/R誘導(dǎo)p-PI3K/AKT激活在Hesp干預(yù)后進(jìn)一步上調(diào)，并伴隨凋亡與氧化應(yīng)激反應(yīng)的下調(diào)；而特異性抑制PI3K/AKT通路后，Hesp的腎臟保護(hù)功能被明顯抑制。既往研究聯(lián)合本實驗證據(jù)為Hesp減輕腎臟I/R損傷增加了新的理論依據(jù)和潛在干預(yù)靶點，通過Hesp途徑靶向調(diào)控PI3K/AKT可能為防治腎臟I/R損傷提供有效途徑。此外，鑒于Hesp在調(diào)控多種信號通路〔如 Janus激酶(JAK)2/轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3、Wnt/β-catenin通路等〕中的藥理學(xué)活性〔13，14〕，其腎臟I/R抑制功能是否依賴性于其他分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。