苗成利 孫春艷 黃梅 郎元君 陳偉達 陳小兵 羅成華

(1北京大學(xué)國際醫(yī)院腹膜后腫瘤外科，北京 102206；2北京源宜基因科技股份有限公司)

近年來，我國各地空氣污染的情況愈加嚴重〔1〕。造成空氣污染的污染物質(zhì)往往是由多種不同的化合物組成的混合物，包括顆粒物(PM)、有毒氣體、有機化合物及有毒金屬等〔2〕，其中PM2.5(PM≤2.5 μm，空氣動力學(xué)直徑≤2.5 μm的大氣懸浮顆粒物)是一種對人體健康威脅最大的空氣污染物〔3〕。PM2.5不僅能增加人體呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率，引起哮喘、肺功能下降、呼吸系統(tǒng)炎癥〔4,5〕，還能夠沉積于肺泡表面并通過肺呼吸屏障進入循環(huán)系統(tǒng)〔6〕，對組織細胞造成損害，引起心血管疾病、糖尿病、惡性腫瘤等〔7,8〕。研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5自身帶有大量活性氧(ROS)，能夠激活細胞氧化反應(yīng)信號通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)的同時導(dǎo)致細胞功能障礙，從而引發(fā)組織損傷和疾病的發(fā)生〔9〕。也有研究報道，PM2.5能夠刺激機體內(nèi)的免疫分子，通過刺激Th2細胞因子表達，引起機體的炎癥反應(yīng)〔10,11〕。

近年來，轉(zhuǎn)錄組測序分析被廣泛應(yīng)用于疾病的研究中，轉(zhuǎn)錄組是細胞在特定狀態(tài)下所有RNA的總和，其中除mRNA外，均為非編碼RNA〔12〕。全轉(zhuǎn)錄組測序分析能夠捕獲編碼RNA和非編碼RNA，并能夠量化細胞、組織乃至整個機體中基因表達的異質(zhì)性，為基因的功能性研究提供參考〔13〕。所以利用轉(zhuǎn)錄組測序分析能夠快速準確地找到與正常組織相比差異性表達的基因并進行分析〔14〕。

本研究利用小鼠模型，將處理的PM2.5硅膠顆粒摻雜到小鼠飼料中，通過飼喂方式使PM2.5直達腸道，取不同時期小鼠的大腸黏膜組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，從基因表達水平探究PM2.5對小鼠腸道疾病發(fā)生的影響。

1 材料和方法

1.1樣品的收集與處理 收集直徑≤2.5 μm的硅膠顆粒，置于北京室外頂樓1個月后回收。BALB/c品系小鼠6～8周齡，18～20 g，將小鼠隨機分為對照組(C1、C2組)和實驗組(P1、P2組)。對照組采用正常飲食，實驗組在食物中混入處理的PM2.5硅膠顆粒(每天18 μg/g)。C1和P1組喂食10 d，C2和P2組喂食30 d，每組取3只，取其腸黏膜進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2轉(zhuǎn)錄組文庫的制備與上機測序 使用NEBNext RNA 超快速文庫制備試劑盒構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫，主要步驟如下：①mRNA 分離和片段化；②第一鏈 cDNA 合成；③第二鏈 cDNA 合成；④純化雙鏈cDNA；⑤末端修復(fù)；⑥連接接頭；⑦片段篩選；⑧文庫富集；⑨文庫純化；⑩文庫質(zhì)檢；使用 Qubit Fluorometer檢測文庫 DNA 質(zhì)量濃度；使用 Qseq100 DNA Analyzer 檢測文庫 DNA 長度分布；使用 KAPA Library Quantification Kit 對文庫 DNA 的摩爾濃度進行定量。

上機測序(Sequencing)將文庫混合、變性后，加入到 Illumina HiSeq測序平臺進行高通量并行測序，具體操作參考使用說明書。測序時，對文庫兩端分別進行測序，因此每個樣本會生成測序片段1和測序片段2兩個數(shù)據(jù)文件。

1.3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析 ①將高通量測序的下機數(shù)據(jù)進行過濾得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)。②參考基因組比對：把高質(zhì)量數(shù)據(jù)與指定的參考基因組比對，計算測序數(shù)據(jù)與參考基因組的比對效率，評估測序數(shù)據(jù)的飽和度和基因的覆蓋度。測序的飽和度是測序量與檢測到基因數(shù)量的關(guān)系，轉(zhuǎn)錄組測序檢測到的基因數(shù)目與測序數(shù)據(jù)量呈正相關(guān)性，但隨著測序量的增加，檢測到的基因數(shù)目會趨于一個穩(wěn)定值。在飽和度的分析結(jié)果中，用檢測到的剪接數(shù)來評估?；蚋采w度分析使用RSeQC分析比對測序片段在各基因上的位置分布，模擬 RNA 片段化結(jié)果，檢驗 RNA 片段化的隨機性。

1.4基因差異表達的分析 在不同樣本分組中篩選差異基因，并對差異基因進行聚類分析及火山圖等可視化展示，對差異基因進行 GO/KEGG 功能注釋及功能富集分析，KEGG信號通路分析能夠更好地了解蛋白的功能注釋及基因在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的生物學(xué)作用〔15〕，發(fā)掘差異基因差異化表達的功能和調(diào)控關(guān)系，采用F檢驗。

1.5RT-PCR 對4組小鼠轉(zhuǎn)錄本進行分析，挑選其中差異表達且富集到炎癥相關(guān)信號通路上的基因設(shè)計引物，進行RT-PCR驗證，選用GAPDH為內(nèi)參基因，驗證基因引物為CD3e正向:5′-ACGATGCCGAGAACATTGAA-3′，反向:5′-TGGGTTGGGAACAGGTGGTG-3′；CD4正向:5′-CAGATTCCCAACCAACAAG-3′，反向:5′-AACCACTGACAACTTTACCCT-3′；Lat正向:5′-TCATCAAGCCACCTCAAATAA-3′，反向:5′-GAGAAGGCACTGTCTCCAAG-3′;Lcp2正向:5′-CCACAGCCGTCACTACCTT-3′,反向:5′-AGCGGATTTGGATGTTGTAAACT-3′;Ptprc正向:5′-TCATCGCCAG-CATCTATCC-3′，反向:5′-AGTCTGCGTTGTCCCACAT-3′;Syk正向:5′-CTCTGGCAGCTAGTGGAACA-3′，反向:5′-TTGGGAAGGAGTAGGATTTGA-3′;Vav1正向:5′-CTAACAATGGCCGATTCAC-3′，反向:5′-TTTGAGGTCGTAAGAGTCCC-3′,Zap70正向:5′-GCCTGCGTGATGCTATGGT-3′，反向:5′-CCTTCAAGCGGTAAATTAGTCC-3′;GAPDH正向:5′-GTGGCAAAGTGGAGATTGTT-3′，反向:5′-TCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 基因覆蓋度分析使用RSeQC分析，用Goseq軟件做富集，并應(yīng)用FDR進行分析。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估 共得到原始測序片段502.298 M，原始堿基數(shù)75.346 G，過濾后C1、C2、P1、P2組分別得到123.278 M、124.489 M、102.584 M、89.417 M過濾后測序片段。不同喂食時期的實驗組和對照組能比對到小鼠參考基因組上的測序片段平均比例為84.69%，其中比對到唯一位置的測序片段的平均比例為76.26%，見表1。

表1 不同喂食條件下小鼠轉(zhuǎn)錄組測序與參考基因組比對情況(n=3)

測序飽和度曲線(圖1A)可以看出，隨著測序片段數(shù)量的增加，檢測到的剪接的數(shù)量逐漸增加，并趨于穩(wěn)定，測序的數(shù)據(jù)量達到分析要求。測序片段在基因 5′端到 3′端分布相對均勻，滿足轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的要求，見圖1B。

2.2差異表達基因 C1組與P1組共353個差異基因，其中319個處于下調(diào)水平，34個處于上調(diào)水平。C2組與P2組共1 018個差異基因，其中437個處于下調(diào)水平，581個處于上調(diào)水平。其中共同差異基因共171個。

2.3差異基因GO富集分析 C1組與P1組的353個差異基因富集到GO數(shù)據(jù)庫3大類(生物過程、細胞組分和分子功能)的38個類別中(圖2)，與C1組相比，P1組小鼠的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，很多基因的表達量處于下調(diào)狀態(tài)，這說明短時間內(nèi)接觸PM2.5硅膠顆粒能夠引起機體內(nèi)一定程度的基因表達異常。C2組與P2組的1 018個差異基因富集到GO數(shù)據(jù)庫3大類的43個類別中(圖3)，轉(zhuǎn)錄組分析顯示，與C2組相比，P2組在生物過程中的免疫過程、細胞定位、代謝過程及細胞組分中的細胞、細胞膜部分基因表達情況有顯著上調(diào)，提示在短期接觸PM2.5硅膠顆粒的時候，機體內(nèi)的部分基因會出現(xiàn)表達下調(diào)的現(xiàn)象，長時間接觸PM2.5硅膠顆粒后，機體內(nèi)相關(guān)的炎癥基因與疾病相關(guān)基因的表達量都會有明顯上調(diào)，說明PM2.5硅膠顆粒在體內(nèi)的積累是誘發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素。

圖1 轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量評估

圖2 C1 vs P1組差異表達基因GO富集分析

圖3 C2 vs P2組差異表達基因GO富集分析

2.4KEGG差異基因富集分析 C1組與P1組和C2組與P2組中共同的差異基因共富集到22條顯著性差異的代謝途徑，見表2，經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，C1組與P1組和C2組與P2組中共同的差異基因富集到的有顯著性差異KEGG通路中，其大部分信號通路都與炎癥發(fā)生和疾病相關(guān)，說明在P2組中其炎癥與疾病相關(guān)的信號通路被顯著性激活。

表2 C1組與P1組中下調(diào)、C2組與P2組中上調(diào)的共同差異表達基因

2.5PM2.5喂食過的小鼠體內(nèi)其炎癥信號通路的相關(guān)基因上調(diào) 見圖4。

圖4 炎癥相關(guān)基因的RT-PCR

通過KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，喂食PM2.5硅膠顆粒30 d的小鼠大腸黏膜組織中的炎癥相關(guān)和疾病相關(guān)的信號通路被顯著激活，為驗證測序結(jié)果，挑選了幾個炎癥相關(guān)信號通路中的相關(guān)基因：Lat,Lcp2,Ptprc,Vav1,Zap70,Syk,CD3e,CD4，設(shè)計引物用GAPDH作為內(nèi)參，在RNA水平上進行驗證，RT-PCR實驗結(jié)果顯示，這些炎癥相關(guān)基因的表達情況與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相一致，在P1組中其表達量有部分下調(diào)，但在P2組，其表達量有一定程度上調(diào)，說明在P2組中，小鼠體內(nèi)的炎癥相關(guān)基因表達量有明顯升高，激活了炎癥相關(guān)信號通路并誘發(fā)炎癥反應(yīng)。

3 討 論

研究表明，長期暴露于空氣污染會促使大腦結(jié)構(gòu)的損傷，損傷中老年個體的認知功能〔16〕，不僅如此，環(huán)境污染的程度與兒童支氣管炎癥狀的加劇有關(guān)，表明減少空氣污染有益于哮喘的控制〔17〕。PM2.5作為空氣污染中最重要的致病成分，也受到了高度重視。研究表明，PM2.5在空氣中濃度增高會增加一些疾病的患病風(fēng)險〔18〕，會使肺炎的發(fā)病率顯著升高，由于生物體生理結(jié)構(gòu)的特點，呼吸道與食道相通，所以當PM2.5在吸入機體的時候，也會有一部分PM2.5進入食道，通過食道進入機體中，而且鑒于腸道的特殊結(jié)構(gòu)，PM2.5在到達腸道之后，能夠在此累積，本文中通過利用PM2.5硅膠顆粒喂食小鼠的實驗方法探討了PM2.5對于腸道疾病發(fā)生的影響。

轉(zhuǎn)錄組測序近年來被廣泛應(yīng)用于基因表達水平的研究〔19〕，相較于傳統(tǒng)的基因組測序而言，轉(zhuǎn)錄組測序更能體現(xiàn)基因表達的差異性，特別是基因在時間和空間表達的差異性〔20〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PM2.5會在腸道中累積，少量的PM2.5會引起基因表達的普遍下調(diào)，總體影響不明顯，但積累到一定量的時候就會激活機體免疫相關(guān)信號通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)并可能進一步導(dǎo)致疾病的發(fā)生，但其具體的作用機制目前還不明確。由于很多疾病的發(fā)生是由于免疫失調(diào)導(dǎo)致的，腸道黏膜內(nèi)炎癥因子與炎癥抑制性因子的平衡失調(diào)導(dǎo)致了腸道炎癥的發(fā)生及慢性炎癥的出現(xiàn)。有研究表明，慢性黏膜炎癥和組織損傷易使炎癥性腸病患者發(fā)展為結(jié)直腸癌，且風(fēng)險隨著炎癥的持續(xù)時間和嚴重程度而增加〔21〕。本研究結(jié)果還說明，長期暴露于PM2.5濃度較高的環(huán)境下，不僅會導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病，也可能會引起腸道或機體內(nèi)其他組織疾病，而且會使結(jié)直腸癌的患病率大大增加。