朱雯菲 付朝旭 代霖 許妍姬

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，吉林 延吉 133000)

老年性癡呆又稱阿爾茨海默病(AD)，一種呈進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病?；颊哒J(rèn)知功能逐漸惡化且發(fā)展不可逆轉(zhuǎn)。病因迄今未明，并且仍未找到能夠有效遏制或治療AD且毒副作用較小的藥物。AD的神經(jīng)病理學(xué)特征是β-淀粉樣蛋白(Aβ)斑塊在細(xì)胞外沉積，即老年斑(SP)及高度磷酸化的tau蛋白構(gòu)成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)〔1〕。Aβ和淀粉樣前體蛋白(APP)-β-分泌酶C-末端片段(CTFs)可以引起糖原合成酶激酶(GSK)-3β的過度興奮和tau磷酸化水平升高〔2〕，而GSK-3β是AD病理作用中的重要調(diào)控基因，GSK-3β在Ser-9位磷酸化時(shí)，其活性被抑制，可促進(jìn)神經(jīng)元存活，提高細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。SP的主要核心成分APP經(jīng)過β、γ-分泌酶酶解產(chǎn)生Aβ，但經(jīng)過α-分泌酶通過非淀粉樣途徑代謝卻會(huì)產(chǎn)生可溶性片段 sAPPα，sAPPα具有保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)作用，能競(jìng)爭(zhēng)性減少 Aβ 產(chǎn)生，從而延緩 AD 發(fā)展〔3〕。APP酶解異常是AD病理機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，β、γ-分泌酶活性增高且α-分泌酶活性減低，可使Aβ和APP-CTFs產(chǎn)生過量，是AD病理開始的最根本基礎(chǔ)。中草藥因其多途徑、多靶點(diǎn)的綜合調(diào)治作用在AD治療中受到越來越多的關(guān)注，有研究表明，刺五加對(duì)神經(jīng)變性疾病如老年性癡呆或帕金森病有保護(hù)作用〔4〕。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各種酶的相關(guān)基因如α-分泌酶整合素-金屬蛋白酶(ADAM)10(α-)、β-分泌酶(BACE)1、γ-分泌酶(PS)1蛋白表達(dá)水平，探討刺五加對(duì)衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及APP酶解通路的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2月齡昆明種雄性小鼠70只，體重16～20 g，由延邊大學(xué)動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。隨機(jī)分為正常對(duì)照、衰老模型、衰老+刺五加低劑量、衰老+刺五加中劑量、衰老+刺五加高劑量、刺五加高劑量、衰老+維生素E組7組，每組10只，在其適應(yīng)條件下飼養(yǎng)5 d后開始建AD模型。

1.2藥品與試劑 刺五加藥材由中國(guó)北京同仁堂有限責(zé)任公司提供。0.9%生理鹽水、D-半乳糖(Solarbio LIFE SCIENCES)；維生素E購于聊城澳鍵生物技術(shù)有限公司(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)食健字G20150980)；鼠α-、β-、γ-分泌酶、鼠Aβ1～42、鼠sAPPα酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒均購于上海酶聯(lián)生物科技；磷酸化(Phospho)-GSK-3β(Ser9)抗體、抗微管蛋白、GSK-3β抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑均購于碧云天生物技術(shù)，抗ADAM10抗體、抗BACE1抗體、抗膜蛋白1抗體購于英國(guó)abcam公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 脫式搖床(金壇市科技儀器)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器，HH-6)、TG-328B 型分析天平(上海天平儀器廠)、移液器(芬蘭，Biohit)、SMART V3.0行為學(xué)視頻追蹤系統(tǒng)(美國(guó) Hayward 公司) 、酶標(biāo)儀(南京華東電子)、超聲波細(xì)胞破碎機(jī)(上海喬躍電子)、制冰機(jī)(日本Sanyo)、電泳儀(碧云天生物技術(shù))、微量振蕩器(無錫縣金城儀器廠，型號(hào) WZS-2A)、小動(dòng)物避暗穿梭測(cè)試儀(北京眾實(shí)迪創(chuàng)，型號(hào)YLS-17B)、小動(dòng)物跳臺(tái)記錄儀(北京眾實(shí)迪創(chuàng)，型號(hào)YLS 3TB)、Morris 水迷宮(上海欣軟)、恒溫CO2培養(yǎng)箱(THERMO 3111型)、高速冷凍離心機(jī)(法國(guó) Thermo Electron，型號(hào) CR3i)、干式恒溫器(江蘇海門市其林貝爾儀器制造，GL-150B)。

1.4刺五加提取液配制步驟 取0.5 kg刺五加，于水中浸泡1 h后加入1.5 kg水。煮沸1 h后再次加入1.5 kg水，共重復(fù)提取3次，最終將提取液合并，濃縮至500 ml,而后加水配制為25%(250 g/L)、50%(500 g/L)、75%(750 g/L)的刺五加溶液〔5〕。

1.5衰老模型建立 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物依照體重0.1 ml/10 g的劑量原則給藥，建模所用D-半乳糖濃度為20 mg/ml，維生素E(40 mg/kg)各組均每日上午十時(shí)頸部注射，正常對(duì)照組頸部皮下注射0.9%生理鹽水間隔8 h后灌胃等體積的一蒸水；衰老模型組皮下注射D-半乳糖間隔8 h灌胃等體積一蒸水；衰老+刺五加低、中、高劑量組皮下注射D-半乳糖間隔8 h灌胃等體積25%、50%、75%刺五加提取液；刺五加高劑量組頸部皮下注射0.9%生理鹽水間隔8 h灌胃等體積75%刺五加提取液；衰老+維生素E組皮下注射D-半乳糖間隔灌胃等體積維生素E。連續(xù)染毒55 d，實(shí)驗(yàn)總時(shí)長(zhǎng)60 d。每日記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的狀態(tài)、體重、攝食與飲水量。

1.6Morris水迷宮測(cè)試 實(shí)驗(yàn)第53天時(shí)進(jìn)行Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練。于每日2點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行訓(xùn)練，水溫控制在(20±2)℃，水迷宮池面平均分為4個(gè)象限，每天將小鼠頭朝向池壁，分別從第一、二、三、四象限的入水點(diǎn)放入水池。假設(shè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在訓(xùn)練過程中60 s內(nèi)找到平臺(tái)，并在指定位置處停留時(shí)間長(zhǎng)達(dá)5 s，則為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物找到平臺(tái)，而后讓其在該位置停留10 s，增加記憶；若沒有在60 s內(nèi)找到平臺(tái)，需要引導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物找到臺(tái)子并使其在臺(tái)子上停留10 s。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行6 d的實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練，于第7天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)將平臺(tái)去除，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從平臺(tái)的對(duì)側(cè)象限放入，記錄穿臺(tái)數(shù)目并且記錄尋找時(shí)間(逃避潛伏期)及活動(dòng)軌跡〔6〕。

1.7避暗實(shí)驗(yàn) 58 d時(shí)訓(xùn)練，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放置在避暗儀中，讓其適應(yīng)環(huán)境，3 min后打開明暗室之間的隔板，開啟避暗儀，訓(xùn)練5 min，每日訓(xùn)練1次，連續(xù)2 d后進(jìn)行測(cè)試，記錄潛伏期及5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)。

1.8跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 58 d時(shí)訓(xùn)練，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放入跳臺(tái)箱內(nèi)，讓其適應(yīng)環(huán)境，在3 min后底部通電，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受到電擊，跳至平臺(tái)上躲避傷害性刺激，多次訓(xùn)練后小鼠會(huì)形成記憶繼而不跳下臺(tái)子，藥物因素(腦損傷)的改變會(huì)增加或者削弱這種記憶保留時(shí)間。24 h后重新測(cè)試，記錄各組第一次從平臺(tái)跳下所需的時(shí)間(跳臺(tái)潛伏期)和5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)，若動(dòng)物在觀察期內(nèi)未跳下平臺(tái)，錯(cuò)誤次數(shù)計(jì)為0，跳臺(tái)潛伏期計(jì)為觀察時(shí)間。

1.9腦組織中 α、β、γ-分泌酶、sAPPα、Aβ1～42含量檢測(cè) 處死小鼠后于冰上取腦，天平稱重后按9(ml)：1(g)比例稀釋，剪碎后用超聲粉碎機(jī)粉碎，所有操作在冰上進(jìn)行。樣本處理后，上清液采用 ELISA 法檢測(cè)，按照說明書嚴(yán)格操作。

1.10腦組織中ADAM10、BACE1、PS1、GSK-3β、Phospho-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用蛋白印跡法，殺鼠后取出的腦組織經(jīng)過剪碎、超聲粉碎、離心后取上清，嚴(yán)格按照BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書操作得到蛋白濃度。之后進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，配制SDS-PAGE 凝膠，待凝固后，注入濃縮膠，插入梳子。按比例稀釋蛋白樣品后將其置于100℃恒溫器中，加熱 3～5 min，使之充分變性，取出后放在冰上冷卻，降溫后用小離心機(jī)離心，之后加樣。電泳儀電泳分離蛋白，電壓70 V進(jìn)行30 min后轉(zhuǎn)為90 V直至樣本轉(zhuǎn)移到達(dá)底部，將儀器轉(zhuǎn)換為200 mA電流使印跡轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，洗滌液洗去殘留的轉(zhuǎn)膜液，封閉液封閉 2 h，一抗搖床1.5 h,再 4℃孵育過夜，次日回收一抗，洗滌后加入二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，回收二抗，再次洗滌后用超敏電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒顯影，曝光取影。以β-tubulin作為內(nèi)參，計(jì)算蛋白表達(dá)情況。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果 衰老模型組潛伏期實(shí)驗(yàn)第1～6天較正常對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，刺五加高劑量組潛伏期從第一天開始以緩慢下降趨勢(shì)縮短，作用效果逐漸加強(qiáng)，第6天效果最為顯著(P<0.05)。和衰老模型組相比，衰老+刺五加提取液中、高劑量組潛伏期顯著縮短(P<0.05)。衰老+維生素E組和衰老+刺五加高劑量組效果相似，對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力有一定鞏固和提高作用。見表1。

表1 各組觀察各時(shí)間點(diǎn)定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期

與正常對(duì)照組比較:1)P<0.05;與衰老模型組比較:2)P<0.05；與前一天比較：3)P<0.05；下表同

2.1.2空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 刺五加高劑量組目標(biāo)象限停留時(shí)間最長(zhǎng)，穿臺(tái)次數(shù)高于其他組別，衰老模型組目標(biāo)象限停留時(shí)間，穿臺(tái)次數(shù)都是最低的，空間記憶障礙明顯(P<0.05)。各組游泳速度未見明顯差異(P>0.05)。見表2。正常對(duì)照組具有很強(qiáng)的空間學(xué)習(xí)能力，而刺五加高劑量組不僅學(xué)習(xí)能力強(qiáng)，且具有更強(qiáng)的目的性，游泳軌跡多集中于目標(biāo)象限,活動(dòng)位置極其靠近平臺(tái)。衰老模型組學(xué)習(xí)記憶能力極差，游動(dòng)軌跡漫無目的毫無規(guī)律，衰老+刺五加低、中、高劑量組學(xué)習(xí)能力逐漸好轉(zhuǎn)，游動(dòng)軌跡有向目標(biāo)象限探索的趨勢(shì)，且對(duì)平臺(tái)位置的記憶越來越清晰，游動(dòng)軌跡有很強(qiáng)的目的性。見圖1。

2.2避暗和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 與正常對(duì)照組比較，衰老模型組潛伏期明顯縮短，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加(P<0.05)；和衰老模型組相比，衰老+刺五加中、高劑量組潛伏期明顯增長(zhǎng)(P<0.05)，衰老+刺五加高劑量組錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P<0.05)。見表2。

圖1 各組空間探索實(shí)驗(yàn)活動(dòng)軌跡

組別空間探索實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)象限停留時(shí)間(s)穿越平臺(tái)次數(shù)(次)游泳速度(mm/s)避暗實(shí)驗(yàn)潛伏期(s) 錯(cuò)誤次數(shù)(次)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)潛伏期(s)錯(cuò)誤次數(shù)(次)正常對(duì)照組12.26±4.235.80±1.98297±30.56156.6±18.443.1±1.19 214.2±34.06 4.9±1.96衰老模型組7.92±2.651)2.10±1.161)274±41.6577.8±37.561) 5.6±2.501)45.7±21.371) 11.5±3.371)衰老+刺五加低劑量組8.25±2.153.20±1.85265±53.6191.9±17.50 4.5±2.22 64.7±40.759.7±4.00衰老+刺五加中劑量組10.04±4.592)3.90±1.432)270±33.47128.5±17.672)3.7±2.16140.1±31.712) 8.4±3.23衰老+刺五加高劑量組11.35±3.252)5.00±1.292)268±50.12138.4±27.942)2.1±0.872)188.5±25.492) 7.11±2.892)刺五加高劑量組16.76±4.871)7.10±1.341)302±85.36182.6±28.721)2.00±1.151) 245.7±32.853.60±1.241)衰老+維生素E組12.24±2.642)4.30±1.942)287±29.65137.6±38.102)3.00±2.002)122.4±33.702) 7.80±2.142)

2.3腦組織α,β,γ-分泌酶活性及sAPPα，Aβ1-42含量 與正常對(duì)照組比較，衰老模型組α-分泌酶、sAPPα含量明顯降低(P<0.05)，β、γ-分泌酶、Aβ1～42含量明顯增高(P<0.05)；刺五加高劑量組α-分泌酶含量明顯增高(P<0.05)，β、γ-分泌酶和Aβ1～42含量明顯降低(P<0.05)；與衰老模型組相比，衰老+刺五加處理組、衰老+維生素E組的α-分泌酶、sAPP含量顯著增高(P<0.05)，β、γ-分泌酶、Aβ1～42含量明顯降低(P<0.05)，且作用效果隨著刺五加提取液濃度的升高而增強(qiáng)；維生素E的作用效果和刺五加提取液比較相對(duì)較弱。見表3。

表3 各組腦組織α,β,γ-分泌酶活性、sAPPα、Aβ1～42含量比較

2.4各組腦組織ADAM10、BACE1、PS1、GSK-3β、Phospho-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組相比，衰老組 BACE1、PS1蛋白表達(dá)水平明顯增強(qiáng)(P<0.05),ADAM10表達(dá)水平減弱，GSK-3β總蛋白明顯上調(diào)，而抑制GSK-3β活性的 Ser9 位點(diǎn)磷酸化水平顯著下調(diào)；與衰老模型組比較，刺五加低、中、高劑量組BACE1、 PS1、GSK-3β、Phospho-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)水平均顯著緩解(P<0.05)，ADAM10表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)。其中，高濃度劑量組效果更好。見圖2和表4。

圖2 各組ADAM10、BACE1、PS1、GSK-3β、Phospho-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)

組別 ADAM10BACE1PS1 GSK-3βPhospho-GSK-3β正常對(duì)照組0.61±0.040.36±0.030.22±0.020.65±0.040.48±0.02衰老模型組0.38±0.021)0.70±0.011)0.68±0.011)0.81±0.031)0.30±0.011)衰老+刺五加低劑量組 0.44±0.030.68±0.030.64±0.030.76±0.020.31±0.02衰老+刺五加中劑量組 0.51±0.012)0.52±0.022)0.56±0.020.70±0.020.38±0.01衰老+刺五加高劑量組0.58±0.042)0.38±0.042)0.39±0.042)0.65±0.012)0.40±0.012)刺五加高劑量組0.59±0.010.29±0.010.37±0.020.59±0.031)0.52±0.021)衰老+維生素E組0.41±0.030.40±0.032)0.40±0.032)0.62±0.030.42±0.022)

3 討 論

APP酶解異常是AD病理機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，Aβ大量累積最終導(dǎo)致AD的形成。應(yīng)用D-半乳糖建立的衰老模型是AD的預(yù)防和治療研究中一個(gè)極有價(jià)值的動(dòng)物模型，D-半乳糖是體內(nèi)一種還原糖，未代謝完全的半乳糖及其代謝物會(huì)堆積于腦組織，阻礙細(xì)胞的正常生物功能，造成細(xì)胞內(nèi)氧自由基(ROS)升高、細(xì)胞脆性增加、損傷，最終使腦功能退化，認(rèn)知損傷、Aβ沉積〔7,8〕。這種出現(xiàn)在生化和組織病理學(xué)方面的表現(xiàn)與在AD患者中觀察到的神經(jīng)退行性變化類似。因此，應(yīng)用D-半乳糖建立的衰老模型已被廣泛應(yīng)用于研究AD的機(jī)制和藥物作用評(píng)估。本研究使用D-半乳糖建立衰老模型基于Aβ假設(shè)模擬AD病理、生化和行為變化，是一個(gè)可靠的研究模型。

中草藥因其多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑的綜合調(diào)控作用在疾病的預(yù)防和治療中越來越受到關(guān)注，從中草藥中尋找能夠天然增加α-分泌酶活性的激活劑及 β、γ-分泌酶的抑制劑對(duì)預(yù)防AD至關(guān)重要。刺五加含有超氧化物歧化酶，有抗氧化、抗自由基的功能，也有增強(qiáng)免疫力的作用〔9〕，其含有的多種活性成分對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)也具有重要的影響〔10〕。本實(shí)驗(yàn)提示刺五加提取液具有增加小鼠學(xué)習(xí)記憶保留時(shí)間，緩解衰老小鼠記憶障礙的功效。有研究表明，維生素E可通過抗氧化作用保護(hù)神經(jīng)元，提高空間記憶能力〔11〕。

本研究顯示，刺五加提取液可以抑制β、γ-分泌酶活性，促進(jìn)α-分泌酶表達(dá)，進(jìn)而減少Aβ1～42的產(chǎn)生，增加具有保護(hù)作用的sAPP生成。研究表明，硒、鋅可以通過抑制β、γ-分泌酶的活性，激活α-分泌酶進(jìn)而遏制過多的 APP 水解為 Aβ1～42〔12〕。本研究結(jié)果在病理機(jī)制上與其保持一致，刺五加提取液可干預(yù)APP酶解機(jī)制，對(duì)AD起預(yù)防和保護(hù)作用。

ADAM10為Aβ裂解過程中的組成α-分泌酶，在減少Aβ的生成中起關(guān)鍵作用。研究表明，無論是在體內(nèi)還是體外，它在減輕AD的病理損害方面都發(fā)揮了有益作用，ADAM10不僅降低了Aβ的生成，還可能通過潛在的機(jī)制影響AD的病理學(xué)，包括抑制tau蛋白磷酸化，維持正常的突觸功能，促進(jìn)海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)態(tài)〔13〕。 BACE1是產(chǎn)生Aβ的限速酶，抑制BACE1的酶活性可減少Aβ產(chǎn)生〔14〕。有研究表明，GSK-3β活化可抑制促神經(jīng)元存活的轉(zhuǎn)錄因子，反之，其失活可促進(jìn)神經(jīng)元存活，提高細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。PS1是γ-分泌酶切割的作用位點(diǎn)〔15〕。很多研究均已報(bào)道GSK-3β與Aβ沉積有關(guān)，也可引起tau蛋白磷酸化水平升高〔16〕，因此，GSK-3β在AD病理作用中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)提示刺五加提取液有抑制β、γ-分泌酶活性，增強(qiáng)α-分泌酶活性的作用。經(jīng)刺五加提取液處理后，GSK-3β和其在Ser9位點(diǎn)的磷酸化水平較衰老組有所改善，提示刺五加可能具有調(diào)控 GSK-3β表達(dá)水平的功效，從而實(shí)現(xiàn)預(yù)防AD的目的。

體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明刺五加提取液對(duì)衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙和腦組織中各種酶的活性變化有較好的保護(hù)作用，刺五加的保護(hù)作用機(jī)制可能是其抗氧化作用。綜上，刺五加提取液對(duì)AD有一定的保護(hù)和治療作用，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)APP酶解通路，減少Aβ的產(chǎn)生和沉積，改善衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，其更深層次的分子生物學(xué)機(jī)制有待研究。