王寧慧 伍棋 于燕妮 郭莉莉

(1貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004；2貴陽市第一人民醫(yī)院)

阿爾茨海默病(AD)的病理機(jī)制與β-淀粉樣蛋白(Aβ)的多個神經(jīng)毒性機(jī)制密切相關(guān)，這些毒性機(jī)制之間相互影響，互為調(diào)節(jié)，形成一個復(fù)雜的多因素循環(huán)作用，貫穿在整個疾病進(jìn)程中。Aβ作為疾病致病分子的認(rèn)識多年來得到公認(rèn)，雖然針對Aβ設(shè)計的靶向臨床藥物并未取得治療上的突破，然而研究者們卻得到了在治療上應(yīng)針對Aβ毒性而非單純針對Aβ本身的重大提示〔1,2〕。致力于多個靶點(diǎn)的毒性對抗，降低Aβ神經(jīng)毒性以期延緩AD進(jìn)程，仍然是AD的主要治療策略之一。課題組利用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù)獲取了AD雙轉(zhuǎn)基因動物腦組織中Aβ毒性相關(guān)的差異蛋白點(diǎn)，同時觀察到燈盞乙素(Scu)主要調(diào)節(jié)了其中12個差異靶蛋白點(diǎn)的療效，包括ATP敏感性鉀通道(KATP)蛋白〔3〕。分化成熟的人源性神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞具有神經(jīng)元的形態(tài)和特性，并表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物，往往被用來制作神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞模型〔4〕，本實(shí)驗利用該細(xì)胞株制作Aβ毒性誘導(dǎo)的反映AD病程的細(xì)胞模型，進(jìn)一步驗證并探討Scu介導(dǎo)KATP路徑對抗Aβ神經(jīng)毒性的療效及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗藥物及細(xì)胞 實(shí)驗Scu為淺棕色粉末(批號：ZL20161012037，純度98%)，由南京澤朗生物醫(yī)藥科技公司提供；Aβ1～42寡聚體購自Sigma公司(編號：A9810)；二氮嗪(DZ)購自Sigma公司(編號：D9035)；SH-SY5Y細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞生物研究所(編號：KCB2006107YJ)。

1.2主要試劑與儀器 CCK8試劑購自同仁公司(日本)；多克隆兔抗Kir6.1購自GenTex公司(美國)；多克隆兔抗Kir6.2、SUR1、SUR2購自Abcam公司(美國)；β-actin抗體購自CST公司(美國)；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；DiBAC4(3)熒光探針購自北京索萊寶科技有限公司；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)和ATP檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司)；流式細(xì)胞儀(美國Beckman Couler公司)；蛋白質(zhì)凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1藥物制備 Aβ1～42用六氟異丙醇(HFIP)進(jìn)行充分溶解并分裝，通風(fēng)櫥過夜風(fēng)干，-80℃保存待用，使用前加二甲基亞砜(DMSO)溶解， 用不含酚紅的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成每管10 μmol/L，4 ℃冰箱放置24 h，離心后取上清使用〔5〕；Scu和DZ 在使用前精確稱量分裝，再用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液充分稀釋，0.22 μm微孔注射濾器過濾后使用。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)液為DMEM高糖培養(yǎng)基，添加12%胎牛血清，1%雙抗，培養(yǎng)箱條件為37℃、5% CO2，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為對照組、Scu處理組、Aβ處理組、Scu+Aβ處理組、DZ+Aβ處理組。對照組不加藥物處理；Scu處理組加入Scu(10 μmol/L)培養(yǎng)48 h；Aβ處理組加入Aβ1～42(1 μmol/L)培養(yǎng)24 h；Scu+Aβ處理組、DZ+Aβ處理組分別加入Scu(10 μmol/L)、DZ培養(yǎng)24 h，再加入Aβ1～42(1 μmol/L)培養(yǎng)24 h。

1.3.3CCK-8法篩選藥物濃度 將細(xì)胞以1×105個/ml的密度接種于96孔板，每孔100 μl，單加磷酸鹽緩沖液(PBS)作為陰性對照，細(xì)胞貼壁后進(jìn)行不同濃度DZ(0、100、200、250、500、1 000、2 000 μmol/L)的加藥處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入CCK-8試劑，CCK-8試劑用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液以1∶10 的比例稀釋后，每孔100 μl均勻加入，放置培養(yǎng)箱孵3 h后用多功能酶標(biāo)儀測定450 nm處OD值，根據(jù)公式存活率=(實(shí)驗組-空白組)/(對照組-空白組)計算各組細(xì)胞存活率。Aβ及Scu的濃度同之前的檢測方法和結(jié)果〔6〕。

1.3.4生物化學(xué)方法檢測各組ATP含量 將細(xì)胞接種于6孔板中，24 h貼壁后進(jìn)行分組處理。各組細(xì)胞分別加入200 μl/孔的裂解液裂解細(xì)胞，4℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清待用。將100 μl/孔 ATP檢測工作液加入96孔板中，室溫放置3～5 min，再加入上述上清或標(biāo)準(zhǔn)品，多功能酶標(biāo)儀(化學(xué)發(fā)光)檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中ATP含量。

1.3.5Western印跡檢測各組細(xì)胞KATP通道亞基內(nèi)向整流鉀通道(Kir)6.1、Kir6.2、磺酰脲受體(SUR)1、SUR2的蛋白表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液，4℃裂解1 h，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清并進(jìn)行BCA蛋白定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)于PVDF膜上，各指標(biāo)一抗和二抗孵育后曝光顯影。以β-actin蛋白作為內(nèi)參照，用ImageJ 軟件對圖像進(jìn)行灰度分析，結(jié)果以各指標(biāo)條帶與β-actin條帶灰度的比值作為各指標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.6DiBAC4(3)熒光探針法檢測各組細(xì)胞細(xì)胞膜電位 將細(xì)胞以1×105個/ml的密度接種于96孔板中，24 h細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組處理后分別加入180 μl的5 μmol/L DiBAC4(3)的檢測用緩沖液，在5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，孵育結(jié)束后再加入20 μl的5 μmol/L DiBAC4(3)的檢測用緩沖液，用多功能酶標(biāo)儀(激發(fā)光488 nm，發(fā)射光517 nm，孵育溫度37℃)觀察各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度變化。

1.3.7JC-1熒光探針法檢測各組細(xì)胞線粒體膜電位 將細(xì)胞以1×105個/ml的密度接種于96孔板中，24 h細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組處理。各組細(xì)胞分別加入50 μl/孔細(xì)胞培養(yǎng)液和50 μl/孔JC-1染色工作液，充分混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃孵育20 min，孵育結(jié)束后吸除上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，最后加入100 μl/孔細(xì)胞培養(yǎng)液，多功能酶標(biāo)儀檢測JC-1聚合體(激發(fā)光525 nm，發(fā)射光590 nm)和JC-1單體(激發(fā)光490 nm，發(fā)射光530 nm)熒光值，線粒體膜電位用JC-1單體熒光值/JC-1聚合體熒光值作為相對比值進(jìn)行計算統(tǒng)計。

1.3.8流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率 將細(xì)胞接種于6孔板中，24 h貼壁后進(jìn)行分組處理。用不含EDTA的胰酶(200 μl/孔)消化收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞兩次后，用500 μl上樣緩沖液懸浮細(xì)胞，再依次加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶混勻，室溫避光放置15 min，在1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測，利用Flow-Jo流式分析軟件，計算細(xì)胞總凋亡率。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度DZ對SH-SY5Y細(xì)胞增殖活性的影響 濃度為0、100、200、500、1 000、2 000 μmol/L的DZ作用于SH-SY5Y細(xì)胞48 h后的細(xì)胞存活率分別為(100.00±0.00)%、(103.47±8.16)%、(92.36±3.38)%、(65.32±3.75)%、(48.81±4.26)%、(30.31±5.54)%。0～200 μmol/L DZ作用于細(xì)胞48 h后細(xì)胞增殖活性無明顯變化，500～2 000 μmol/L作用后細(xì)胞的增殖活性呈不同程度的下降，毒性作用呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，選擇200 μmol/L作為DZ實(shí)驗用濃度。

2.2各組細(xì)胞ATP含量 與對照組〔(9.57±0.62)nmol/mg〕和Scu處理組〔(9.86±1.18)nmol/mg〕相比，Aβ處理組〔(6.84±0.68)nmol/mg〕ATP含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Scu干預(yù)后〔Scu+Aβ處理組(8.78±0.73)nmol/mg〕，ATP含量有所升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；DZ干預(yù)后〔DZ+Aβ處理組(7.22±0.30)nmol/mg〕，ATP含量也有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2的蛋白表達(dá) 與對照組和Scu處理組相比，Aβ處理組Kir6.1、SUR2的蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，Kir6.2、SUR1的表達(dá)無明顯變化；Scu干預(yù)后，Kir6.1、SUR2的蛋白表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，未見Kir6.2、SUR1的表達(dá)變化。DZ+Aβ處理組的表現(xiàn)與Scu+Aβ處理組基本一致。見表1，圖1。

1～5:對照組;Scu處理組;Aβ處理組；Scu+Aβ處理組；DZ+Aβ處理組圖1 各組細(xì)胞中Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2蛋白表達(dá)水平

組別Kir6.1Kir6.2SUR1SUR2對照組0.65±0.060.86±0.060.53±0.060.68±0.05Scu 處理組0.64±0.140.86±0.160.54±0.090.66±0.12Aβ處理組1.09±0.231)0.84±0.060.55±0.031.02±0.081)Scu+Aβ處理組0.74±0.122)0.88±0.140.56±0.050.76±0.072)DZ+Aβ處理組0.67±0.162)0.85±0.120.57±0.050.77±0.102)

與對照組比較：1)P<0.01；與Aβ處理組比較：2)P<0.01

2.4各組細(xì)胞細(xì)胞膜電位變化 與對照組(6.86±0.05)和Scu處理組(6.79±0.05)相比，Aβ處理組(7.38±0.14)的熒光值有所升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表示細(xì)胞膜膜電位升高，呈現(xiàn)去極化現(xiàn)象；而與Aβ處理相比，Scu+Aβ處理組(6.86±0.20)的熒光值趨向于正常，但差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表示膜電位的去極化現(xiàn)象有所改善。DZ+Aβ處理組(6.90±0.33)的表現(xiàn)與Scu+Aβ處理組基本一致。

2.5各組細(xì)胞線粒體膜電位變化 與對照組(1.03±0.07)和Scu處理組(1.03±0.04)相比，Aβ處理組(1.43±0.02)的熒光值有所升高，但差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表示細(xì)胞膜膜電位升高，呈現(xiàn)去極化現(xiàn)象；而與Aβ處理相比，Scu+Aβ處理組(1.23±0.05)的熒光值趨向于正常，但差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表示膜電位的去極化現(xiàn)象有所改善。DZ+Aβ處理組(1.22±0.04)的表現(xiàn)與Scu+Aβ處理組基本一致。

2.6各組細(xì)胞總凋亡率 與對照組(4.18%±0.63%)和Scu處理組(4.25%±0.42%)相比，Aβ處理組(17.58%±0.48%)細(xì)胞總凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Scu干預(yù)后，細(xì)胞總凋亡率(11.23%±0.84%)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。DZ+Aβ處理組(9.67%±1.03%)的表現(xiàn)與Scu+Aβ處理組基本一致。

3 討 論

KATP是一種與細(xì)胞能量代謝密切相關(guān)的配體門控鉀通道，受腺苷酸的調(diào)節(jié)直接將細(xì)胞的代謝狀態(tài)與電活動相耦聯(lián)，在神經(jīng)系統(tǒng)中起神經(jīng)元保護(hù)作用〔7〕。細(xì)胞內(nèi)ATP是KATP通道的主要調(diào)節(jié)劑，通道的開閉直接受其調(diào)控，正常細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)ATP濃度約為10 nmol/mg蛋白，此時KATP處于穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)外環(huán)境刺激時，胞質(zhì)內(nèi)ATP濃度發(fā)生適應(yīng)性下降，觸發(fā)KATP開放。細(xì)胞膜上的KATP開放時，K+外流，細(xì)胞膜超極化，抑制細(xì)胞膜上電壓依賴性離子通道的開放，比如抑制電壓依賴性鈣離子通道，可減少鈣內(nèi)流，減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載誘發(fā)的凋亡，同時也能減少動作電位的發(fā)生，減少能量消耗；線粒體膜上的KATP開放時，線粒體膜超極化，可維持線粒體膜電位，穩(wěn)定線粒體體功能，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的開放，減少氧自由基和凋亡啟動因子釋放，進(jìn)而減少氧化應(yīng)激損傷和凋亡發(fā)生〔8〕。我們在實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，Aβ的毒性刺激使細(xì)胞內(nèi)ATP的濃度明顯下降，細(xì)胞膜和線粒體膜電位呈現(xiàn)去極化改變，表明Aβ刺激了ATP調(diào)節(jié)下的KATP開放，神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自主調(diào)節(jié)的生物學(xué)行為，然而，細(xì)胞凋亡率的增加，代表這種適應(yīng)性反應(yīng)遠(yuǎn)不足以抵消Aβ造成的細(xì)胞損傷。

KATP主要分布在神經(jīng)元、胰腺β細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞膜和線粒體膜表面，由4種Kir和4種SUR組成，Kir家族形成通道孔，Kir6為ATP敏感，目前確定的有Kir6.1和Kir6.2兩種亞基，SUR為ATP結(jié)合蛋白的“超家族”，構(gòu)成通道調(diào)控元件，包括SUR1和SUR2兩種亞基。研究發(fā)現(xiàn)，KATP通道亞基在腦內(nèi)廣泛表達(dá)(包括在與認(rèn)知能力密切相關(guān)的海馬區(qū)域，海馬區(qū)主要以Kir6亞基表達(dá)為主)〔9〕，我們同樣觀察到實(shí)驗用神經(jīng)元細(xì)胞中均呈現(xiàn)出Kir6.1、Kir6.2、SUR1和SUR2的蛋白表達(dá)，且Aβ的處理引起了Kir6.1和SUR2的蛋白表達(dá)上調(diào)，對Kir6.2和SUR1的蛋白表達(dá)并無影響，代表Aβ觸發(fā)的KATP通道開放選擇性作用于Kir6.1/SUR2亞基。與此同時，我們觀察到在Scu干預(yù)后，Aβ刺激下細(xì)胞內(nèi)ATP的濃度水平與細(xì)胞膜和線粒體膜電位的變化趨向于正常，Kir6.1和SUR2的蛋白表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞總凋亡率明顯下降，顯示出Scu可能通過調(diào)節(jié)KATP通道蛋白Kir6.1/SUR2亞基的表達(dá)，或者是降低KATP通道對細(xì)胞內(nèi)ATP的敏感性而激活了通道開放，在Aβ的毒性影響下發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。

KATP通道現(xiàn)已成為包括神經(jīng)變性性疾病在內(nèi)的多種疾病的治療靶點(diǎn)，多種KATP通道開放劑(KCOs)被應(yīng)用于臨床并取得較好療效，不同類型的KCOs通過不同方式選擇性作用于KATP通道蛋白〔10〕。二氮嗪(DZ)作為KCOs的一種類型被證實(shí)可以用來延緩Aβ毒性導(dǎo)致的細(xì)胞損傷〔11〕，有研究顯示其可激活心肌細(xì)胞膜上的Kir6.1/SUR2亞型KATP通道來介導(dǎo)對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)，實(shí)驗中DZ對ATP濃度的影響無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與其主要是增加細(xì)胞內(nèi)二磷酸腺苷(ADP)的濃度有關(guān)。我們觀察到Scu發(fā)揮了與DZ基本相一致的作用，提示Scu存在作為KCOs應(yīng)用來降低Aβ毒性的可能。

課題組在同期實(shí)驗中觀察到，Scu能夠通過干預(yù)APP代謝的β分泌酶途徑來抑制Aβ的生成〔12〕；能夠通過對IP3R-Ca2+途徑的調(diào)控和介導(dǎo)MPTP的開放來抑制Aβ毒性所致的細(xì)胞凋亡〔13〕；能夠調(diào)節(jié)Aβ毒性所致神經(jīng)元中組蛋白H2A、H2B、H3的表達(dá)，通過改變AD表觀遺傳的信息異常來發(fā)揮預(yù)防和治療作用〔14〕等。綜上所述，我們推測其還可能通過調(diào)控ATP介導(dǎo)的KATP通道開放來抑制Aβ毒性所致的細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用，本實(shí)驗為藥物針對Aβ毒性在AD治療中產(chǎn)生積極影響提供了新的實(shí)驗依據(jù)。