楊超 楊佳 劉玲

(1湖北中醫(yī)藥大學(xué)2016級博士研究生，湖北 武漢 430061；2湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院老年病科；3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科；4湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院 湖北省中醫(yī)院)

血管性癡呆(VD) 是指由缺血性腦卒中、出血性腦卒中和造成記憶、認(rèn)知和行為等腦區(qū)低灌注的腦血管疾病所致的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)〔1〕，我國65歲以上人群VD的患病率為1.1%～3.0%。滌痰湯是臨床治療癡呆的經(jīng)典方劑，可有效改善VD患者的認(rèn)知功能障礙，但是滌痰湯治療VD的具體作用機(jī)制尚不明確。慢性腦缺血是VD的重要病理基礎(chǔ)之一，由慢性腦缺血引起的氧化應(yīng)激失衡在VD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。本研究通過觀察滌痰湯對VD大鼠動(dòng)物行為學(xué)、海馬組織病理學(xué)及氧化應(yīng)激損傷的影響，探討滌痰湯治療VD的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔SPF級Wistar大鼠40只，雄性，鼠齡8～10 w，體重(200±20)g，購于湖北省疾控中心，許可證編號：SCXK(鄂) 2008-0004。飼養(yǎng)于室溫21～25℃、相對濕度為60%～65%、自然光照的SPF級實(shí)驗(yàn)室。自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物 滌痰湯由制天南星8 g，制半夏8 g，炒枳實(shí)6 g，茯苓6 g，橘紅5 g，石菖蒲3 g，人參3 g，竹茹2 g，甘草1.5 g，生姜5 g組成，購于湖北省中醫(yī)院中藥房，由湖北省中醫(yī)院藥劑科制備，分別濃縮成含生藥量0.971 g/ml、0.485 g/ml兩個(gè)不同濃度溶液，無菌條件裝瓶，4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3主要試劑 蘇木素-伊紅(HE)染色所需試劑由國家中醫(yī)藥管理局老年性癡呆(醒腦益智)重點(diǎn)研究室提供；RIPA裂解液(貨號G2002)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔(貨號G23303)、HRP標(biāo)記驢抗山羊(貨號G23404)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠(貨號G23301)、HRP標(biāo)記山羊抗大鼠(貨號G23302)購于武漢谷歌生物科技有限公司；活性氧(ROS，貨號：E004)、谷胱甘肽(GSH，貨號：A006-1)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.4主要儀器設(shè)備 SA201 Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)，DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)，V300型掃描儀(EPSON)。

1.5模型制備 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，采用改良的大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法制備VD大鼠模型：大鼠術(shù)前12 h禁食，6 h禁水，給予10%水合氯醛(0.3 ml/100 g) 腹腔注射麻醉，將其仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，頸前部手術(shù)區(qū)域去毛，碘酒消毒，取頸前正中切口，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，用0號手術(shù)線結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈的近心端和遠(yuǎn)心端，用剪刀從中間剪斷，依次逐層縫合。1 w后在同樣條件下，結(jié)扎并剪斷左側(cè)頸總動(dòng)脈。造模結(jié)束1 w后，進(jìn)行Morris水迷宮定位航行檢測，以假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期的均值為參考值，計(jì)算每只大鼠的平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時(shí)間的比例，該值>20%判定為VD鼠。

1.6分組與給藥 將40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、滌痰湯低劑量組、滌痰湯高劑量組，造模成功1 w后開始灌胃，給藥量均按人與大鼠體表面積系數(shù)比確定。滌痰湯高、低劑量組給藥量為滌痰湯折合生藥量9.71 g/kg、4.85 g/kg，假手術(shù)組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)4 w。

1.7觀察指標(biāo)與方法

1.7.1Morris水迷宮測試 Morris水迷宮：圓形水池，周圍避光，水溫保持在24℃左右，水深約30 cm，將水池均分為4個(gè)象限，任選一象限在其中央放置一個(gè)直徑10 cm的圓形平臺(tái)，低于水面2 cm，通過安裝在水迷宮上方的攝像機(jī)追蹤大鼠位置，采集的圖像及視頻及時(shí)傳入實(shí)驗(yàn)配套計(jì)算機(jī)并通過水迷宮分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。檢測時(shí)間為5 d，前4 d為定位航行測試，第5天為空間搜索實(shí)驗(yàn)。定位航行測試：將各組大鼠按照1～4四個(gè)象限的順序放入水中，記錄120 s內(nèi)大鼠從入水到找到平臺(tái)后四肢爬上平臺(tái)并停留超過20 s所需的時(shí)間(即逃避潛伏期)，如果大鼠在120 s內(nèi)找到平臺(tái)，并停留超過20 s，記錄120 s中實(shí)際逃避潛伏期；如果在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)者將大鼠引上平臺(tái)并停留5 s，逃避潛伏期記錄為120 s。每天4次，連續(xù)4 d，取平均值?？臻g搜索實(shí)驗(yàn)：第5天，將平臺(tái)撤除，將大鼠由任意象限放入水中，記錄大鼠在120 s內(nèi)跨越原平臺(tái)的次數(shù)及停留時(shí)間。

1.7.2海馬組織形態(tài)學(xué)觀察 Morris水迷宮結(jié)束后當(dāng)天斷頭處死大鼠，冰上迅速取腦組織，留取包含完整海馬的腦段，迅速置于4%多聚甲醛(4℃，pH7.4)中固定24 h，將固定好的組織經(jīng)過梯度酒精脫水，二甲苯透明后，用石蠟包埋，制作成厚度約4 μm的切片，再經(jīng)過脫蠟、梯度酒精脫水、HE染色后觀察海馬組織學(xué)改變。

1.7.3免疫組化法檢測還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)2蛋白表達(dá) 將上述各組石蠟切片用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，其方法嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。組織中棕黃色或棕褐色顆粒為目標(biāo)蛋白。在光學(xué)顯微鏡下，每張片子隨機(jī)選取 5 個(gè)視野，采用 Leica Qwin 圖像分析系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白NOX2的表達(dá)情況。

1.7.4Western印跡法檢測海馬組織中血紅素氧合酶(HO)-1蛋白表達(dá) 每組稱取100 mg海馬組織，盡量剪碎，置于勻漿器中，加入1 ml RIPA冰上徹底勻漿，轉(zhuǎn)移離心管振蕩，冰浴30 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清，二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉(zhuǎn)膜后，室溫下將膜于脫色搖床上用5%的脫脂牛奶，封閉2 h。封閉液稀釋一抗，4℃孵育過夜。次日，在室溫下脫色搖床上用TBST洗膜3次，每次5 min。之后加入1∶3 000稀釋二抗，室溫下孵育30 min后，用TBST洗膜3次，每次5 min。電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影、定影及曝光后，Alpha軟件處理系統(tǒng)對目標(biāo)帶經(jīng)行分析。

1.7.5海馬組織ROS、GSH含量檢測 準(zhǔn)確稱取海馬組織1 g，按1∶9(海馬組織重量：生理鹽水體積=1∶9)的比例加入9倍體積的冰生理鹽水，充分研磨制備海馬組織勻漿。4℃，2 500 r/min離心10 min，吸取上清液，即為海馬組織勻漿。嚴(yán)格按照試劑盒操作說明測定ROS、GSH含量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的比較

2.1.1定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果 模型組與假手術(shù)組比較，逃避潛伏期明顯延長〔(39.21±4.52)vs(23.40±4.07)s，P<0.01〕；與模型組比較，滌痰湯高劑量組〔(27.33±4.15)s〕、滌痰湯低劑量組〔(33.32±5.32)s〕，逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01，P<0.05)。

2.1.2空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 模型組與假手術(shù)組比較，大鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)及停留時(shí)間明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，滌痰湯高、低劑量組大鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)及停留時(shí)間明顯增加(P<0.01，P<0.05)。與滌痰湯低劑量組比較，滌痰湯高劑量組穿越原平臺(tái)次數(shù)及停留時(shí)間明顯增加(P<0.05)。見表1。

2.2海馬組織病理學(xué)觀察 假手術(shù)組海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量正常，形態(tài)飽滿，染色均勻，細(xì)胞邊界分明，細(xì)胞膜、核膜清楚，細(xì)胞核呈類圓形。模型組海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少，可見壞死的神經(jīng)元，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，染色不均勻，細(xì)胞邊界模糊，細(xì)胞膜、核膜不清晰，細(xì)胞核固縮。與模型組對比，滌痰湯高劑量組、低劑量組神經(jīng)元數(shù)量增多，細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，染色較均勻，細(xì)胞邊界較清晰。見圖1。

表1 各組空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

與假手術(shù)組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01，3)P<0.05；與中藥高劑量組比較:4)P<0.05；下表同

圖1 各組海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE，×400)

2.3各組NOX2表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組NOX2蛋白相對表達(dá)量明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，滌痰湯高劑量組、滌痰湯低劑量組NOX2蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.01，P<0.05)；與滌痰湯低劑量組比較，滌痰湯高劑量組NOX2蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表2、圖2。

2.4各組HO-1蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組HO-1蛋白相對表達(dá)量明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，滌痰湯高劑量組、滌痰湯低劑量組HO-1蛋白相對表達(dá)量顯著增高(P<0.01，P<0.05)；與滌痰湯低劑量組比較，滌痰湯高劑量組HO-1蛋白相對表達(dá)量顯著增高(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 各組海馬 NOX2表達(dá)灰度及HO-1蛋白表達(dá)比較

圖2 各組海馬NOX2蛋白表達(dá)比較(DAB，×400)

圖3 各組海馬HO-1蛋白的表達(dá)

2.5各組ROS、GSH含量比較 與假手術(shù)組比較，模型組海馬組織勻漿ROS含量明顯升高(P<0.01)，GSH含量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，滌痰湯高劑量組、滌痰湯低劑量組ROS含量明顯降低(P<0.01，P<0.05)，GSH含量明顯升高(P<0.01，P<0.01)；與滌痰湯高劑量組比較，滌痰湯低劑量組ROS含量明顯升高(P<0.05)，GSH含量明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組海馬組織勻漿ROS、GSH含量比較

3 討 論

VD屬于中醫(yī)學(xué)“愚癡病”、“呆病”等疾病范疇，病位在腦，涉及五臟。痰濁當(dāng)為VD發(fā)生認(rèn)知障礙的病機(jī)中心環(huán)節(jié)，清代陳士鐸在《石室秘錄》中說：“痰勢最盛，呆氣最深”，指出痰濁盛則癡呆重?，F(xiàn)代學(xué)者通過認(rèn)知功能評價(jià)量表對血管性認(rèn)知障礙患者認(rèn)知功能與中醫(yī)證候的相關(guān)性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)痰濁與認(rèn)知障礙關(guān)系密切〔2～4〕。祛痰開竅是改善VD認(rèn)知障礙的有效方法。而作為臨床上治療癡呆的經(jīng)典名方滌痰湯，出自明代方賢所著的《奇效良方》，由制南星、姜半夏、炒枳實(shí)、茯苓、橘紅、石菖蒲、人參、竹茹、甘草、生姜等藥物組成，具有滌痰開竅、醒神定志的功效，使痰濁得化，腦竅得通，使呆病得治，可有效改善VD患者的認(rèn)知功能〔5，6〕?，F(xiàn)代研究表明，石菖蒲揮發(fā)油通過提高腦組織超氧化物歧化酶活力、降低丙二醛含量，對抗脂質(zhì)氧化及自由基的損傷作用，保護(hù)腦組織，從而改善癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力〔7〕。人參皂甙Rb1可能通過降低海馬氧化應(yīng)激水平及減輕海馬神經(jīng)元的凋亡改善VD大鼠認(rèn)知功能障礙〔8〕。

慢性腦缺血缺氧是VD的重要病理學(xué)基礎(chǔ)，缺血缺氧可引起腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷大腦神經(jīng)元導(dǎo)致認(rèn)知功能下降〔9，10〕。NOX2與神經(jīng)元的發(fā)育、活化、增殖、凋亡等過程密切相關(guān)。當(dāng)NOX2過度激活，產(chǎn)生的過多ROS可能損傷自身或鄰近的神經(jīng)細(xì)胞〔11，12〕。抑制NOX2的激活，減少ROS產(chǎn)生，可改善小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力〔9，13〕。

HO-1是機(jī)體重要的抗氧化應(yīng)激酶之一，受核因子E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件通路調(diào)節(jié)，在海馬神經(jīng)元中高表達(dá)〔14〕。當(dāng)大腦處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下，HO-1裂解血紅素產(chǎn)生Fe2+、膽綠素、一氧化碳，膽綠素進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為膽紅素，這些代謝產(chǎn)物可發(fā)揮穩(wěn)定細(xì)胞膜、抗氧化等作用，從而保護(hù)神經(jīng)元〔15〕。通過上調(diào)HO-1的表達(dá)能改善氧化損傷從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用〔16〕。GSH是廣泛存在于機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑之一，在GSH過氧化物酶的催化作用下，GSH與有毒的過氧化物發(fā)生還原反應(yīng)，減輕過氧化物對細(xì)胞膜的損傷。

本研究結(jié)果提示，滌痰湯可能通過調(diào)節(jié)VD大鼠海馬組織的氧化應(yīng)激失衡，從而改善大鼠認(rèn)知功能障礙。其機(jī)制可能與滌痰湯降低NOX2、ROS的表達(dá)，提高HO-1、GSH的表達(dá)，恢復(fù)氧化應(yīng)激平衡有關(guān)。由于VD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，滌痰湯治療VD的詳細(xì)機(jī)制有待深入研究。