金平 潘永明 潘智勇 林敏 佟雅涵 許茂盛

阿爾茨海默?。ˋD）是一種起病隱匿的神經(jīng)退行性疾病，其臨床特征是進(jìn)行性的記憶力減退和認(rèn)知功能障礙，患者最終多因并發(fā)癥死亡［1］。雖然研究人員不斷嘗試研究新的藥物以達(dá)到緩解、治愈AD，但在過去的15年里仍無有效的新藥面世。2017年9月至2018年8月作者通過高膽固醇飲食喂養(yǎng)建立兔AD模型，探討電針“百會(huì)”、“大椎”穴對(duì)高脂喂養(yǎng)兔AD模型腦組織代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 取普通級(jí)3個(gè)月齡雄性日本大耳白兔（JWR）18只，體重2.0kg，隨機(jī)分成3組：（1）AD組6只：利用2%膽固醇飲食喂養(yǎng)12周建立AD模型；（2）正常對(duì)照組6只（normal control，NC）：給予正常基礎(chǔ)飲食喂養(yǎng)12周；（3）電針組6只（electro acupuncture，EA）：喂食方法同AD模型組，并同時(shí)給予電針治療。所有兔子 均飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心普通級(jí)兔實(shí)驗(yàn)室，明暗交替（12h/12h），室內(nèi)溫度維持18℃～22℃，相對(duì)濕度維持40%～60%，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用均符合3 R原則。根據(jù)中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)1992年制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位標(biāo)準(zhǔn)》選用“百會(huì)”、“大椎”穴，針具采用0.25mm×25mm的華佗牌不銹鋼毫針（蘇州醫(yī)療用品有限公司），電針治療采用韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司），刺激參數(shù)為2/100Hz 疏密波，電流為（2±1）mA，持續(xù)時(shí)間30min，1次/d，5次/周，周末休息。

1.2 頭顱MR掃描 實(shí)驗(yàn)兔禁食不禁水12h后，經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液30mg/kg麻醉，待麻醉穩(wěn)定后，將實(shí)驗(yàn)兔以臥位固定并將頭頸部放入動(dòng)物專用線圈位置中，確保兔保持呼吸順暢和心跳平穩(wěn)。采用3.0T磁共振成像系統(tǒng)（GE Discovery MR750），配備兔腦專用線圈（上海晨光公司）。主要MR掃描序列包括：軸位/冠狀位/矢狀位T2WI及1H MRS。MRS掃描用點(diǎn)分辨波譜分析法（PRESS），水抑制法采集信號(hào)，TR=2000ms，TE=35ms，層厚=3mm，掃描層數(shù)128，NEX 8。MR掃描儀自動(dòng)進(jìn)行預(yù)掃描，勻場(chǎng)，使水峰的半高全寬＜20Hz，水抑制＞95%。MRS的體素的位置根據(jù)獲得的軸位/冠狀位/矢狀位T2W圖像確定，體素9mm×16mm×9mm，主要包括雙側(cè)的大部分海馬、部分皮質(zhì)和丘腦（見圖1）。

圖1 MRS定位示意圖

1.3 MRS圖像后期處理及分析 腦內(nèi)代謝物的計(jì)算：利用 LC Model軟件（Version 6.3，Provencher SW）對(duì)MRS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，生成MRS譜線（見圖2）并自動(dòng)獲得包括N-乙酰天冬氨酸/肌酸（NAA/Cr）、谷氨酸 /肌酸（Glu/Cr）、膽堿 /肌酸（Cho/Cr）、肌醇 /肌酸（mI/Cr）在內(nèi)的具有重要生理或病理生理意義的神經(jīng)代謝化合物濃度比。

1.4 兔腦海馬的Aβ1-42蛋白的測(cè)量 經(jīng)兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（30mg/kg）進(jìn)行麻醉，處死后取腦，分離出海馬。使用IKA ULTRA-TURRAX勻漿機(jī)（IKAR-werke Gmbh & Co.，KG）制備10%的海馬組織勻漿，4℃離心10min（4500r/min），后取上清液，測(cè)量海馬Aβ1-42濃度水平，測(cè)量時(shí)使用來自南京建成生物工程研究所的ELISA試劑盒，測(cè)量過程嚴(yán)格按照該試劑盒說明書進(jìn)行。

圖2 MRS譜線

圖3 三組兔MRS結(jié)果比較，? P＜0．05

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5.0軟件。計(jì)量資料用（±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔腦內(nèi)代謝物組間差異 AD組NAA/Cr（0.66±0.07）較NC組（0.81±0.08）和EA組（0.78±0.07）明 顯 減 低（P＜0.05），NC組 NAA/Cr與 EA 組 NAA/Cr差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AD組Glu/Cr（0.64±0.06）較NC組（0.87±0.06）和EA組（0.78±0.09）明顯減低（P＜0.05）；對(duì)照組Glu/Cr與電針組Glu/Cr差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NC組（0.89±0.24）、AD組（0.92±0.14）及EA組（1.01±0.18）三組間MI/Cr差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NC組（0.42±0.03）、AD組（0.44±0.03） 及 EA組（0.44±0.05）三組間（Cho/Cr）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 兔腦海馬的Aβ1-42蛋白濃度 AD組兔海馬的Aβ1-42的表達(dá)（238.62±58.16）pg/mg、明顯高于NC組（155.57±26.17）pg/mg及EA組（166.38±30.92）pg/mg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖4）。

圖4 三組兔腦海馬Aβ1-42濃度比較，?P＜0．05

3 討論

Aβ的異常聚集和沉積是AD發(fā)病中的重要環(huán)節(jié)［2］。高膽固醇血癥可促進(jìn)Aβ在腦內(nèi)的沉積，在AD的發(fā)病中起著重要的作用［3］。AD的臨床表現(xiàn)在中醫(yī)癥候中歸于“癲證”、“呆病”等范疇。百會(huì)和大椎均是手足三陽(yáng)經(jīng)與督脈的交會(huì)之穴?；A(chǔ)研究顯示針刺百會(huì)和大椎穴能顯著提高AD大鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力［4］，本研究旨在基于這些研究的基礎(chǔ)上，利用1H-MRS技術(shù)從腦內(nèi)代謝物濃度改變的角度對(duì)電針百會(huì)、大椎治療AD的效果進(jìn)行探討。

1H-MRS可以無創(chuàng)測(cè)量 NAA/Cr、Glu/Cr、mI/Cr、和Cho/Cr等用于評(píng)估神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嚴(yán)重程度［5］。NAA主要在神經(jīng)元線粒體內(nèi)合成，存在于神經(jīng)元細(xì)胞及其軸突內(nèi)，被認(rèn)為是代表神經(jīng)元功能和密度的生物標(biāo)志物，研究認(rèn)為NAA與神經(jīng)系統(tǒng)的能量代謝密切相關(guān)［6］，其水平的降低可作為判斷神經(jīng)元丟失和損傷的可靠指標(biāo)［7］。Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的興奮性遞質(zhì)，是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)含量最高的氨基酸。Glu水平下降可反映谷氨酸能神經(jīng)元喪失，或Glu 能神經(jīng)元活性降低［8］。

關(guān)于AD患者的腦代謝MRS研究發(fā)現(xiàn)AD患者NAA、Glu濃度較正常對(duì)照組減低，是AD患者典型的腦MRS表現(xiàn)特征［9-10］；而AD患者與對(duì)照組MI、Cho的濃度差異各研究結(jié)果尚不統(tǒng)一［11-14］。本研究中，AD組NAA/Cr和Glu/Cr較NC組明顯減低，與AD的MRS表現(xiàn)相符，提示利用高膽固醇飲食成功誘導(dǎo)日本大白兔AD模型。本研究中EA組兔海馬的Aβ1-42明顯低于AD組，NAA/Cr和Glu/Cr水平明顯高于AD組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，EA組兔海馬Aβ蛋白濃度也明顯低于AD組，提示電針能減緩高脂喂養(yǎng)AD模型兔腦組織內(nèi)神經(jīng)元的損傷。

綜上所述，電針百會(huì)、大椎穴能減緩高脂喂養(yǎng)AD模型兔腦組織代謝AD樣改變的進(jìn)程，為電針有效治療AD提供腦組織代謝方面的依據(jù)。