李玉龍 盧麗莎 孫保國(guó) 陳澤雄

脾氣虧虛，痰瘀毒結(jié)是肝癌發(fā)生發(fā)展的根本病機(jī)。脾氣虧虛，運(yùn)化無(wú)力，導(dǎo)致痰瘀邪毒阻滯于內(nèi)，與機(jī)體免疫功能失調(diào)有密切關(guān)系[1，2]。研究表明，在罹患癌腫機(jī)體中，特異性TCR呈現(xiàn)限制性利用，TCR多態(tài)性被破壞，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能出現(xiàn)失衡，抗腫瘤作用弱化[3，4]。然而在治療的緩解期，機(jī)體的TCR可表現(xiàn)出標(biāo)準(zhǔn)化的狀態(tài)，多態(tài)性增加[5]。T淋巴細(xì)胞通過TCR識(shí)別腫瘤特異性抗原，完成對(duì)腫瘤的免疫識(shí)別后，特異性T細(xì)胞開始進(jìn)行克隆性增殖[6，7]，最終發(fā)揮抗腫瘤的免疫作用[8]。研究表明[9～12]，ERK1/2是T細(xì)胞第一和第二信號(hào)通路活化的最終交匯點(diǎn)，在T細(xì)胞的活化中起至關(guān)重要的作用。健脾益氣、祛邪扶正是中醫(yī)中藥調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的有效治法。健脾解毒方是本課題組治療肝癌的經(jīng)驗(yàn)方[1]。研究提示[2，3]，該方可提高肝癌大鼠的生存能力，延長(zhǎng)肝癌大鼠的生存時(shí)間。目前還不清楚健脾解毒方治療肝癌作用機(jī)制是否與TCR蛋白及T淋巴細(xì)胞的ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)，就此問題設(shè)計(jì)如下研究進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株大鼠肝癌WalKer-256細(xì)胞株購(gòu)于中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 動(dòng)物SPF級(jí)健康 3～4周齡雄性Wistar大鼠，共105只， SPF級(jí)4周齡健康雄性BALB/c裸小鼠，4只，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 藥物小承氣湯(大黃、枳實(shí)、厚樸)，健脾解毒方(黨參、茯苓、白術(shù)、炙甘草、柴胡、莪術(shù)、半枝蓮)，中藥全成分顆粒購(gòu)自廣東一方制藥有限公司，按照比例配制，制成中藥制劑定容為2 g生藥/ml與4 g生藥/ml。注射用胸腺五肽，規(guī)格：10 mg/支，廠家:北京雙鷺?biāo)帢I(yè)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20056810。

1.2 方法

1.2.1 脾虛模型將105只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(A組)、空白肝癌模型組(B組)、脾虛對(duì)照組(C組)、脾虛肝癌模型組(D組)、健脾解毒方低濃度組(E組)、健脾解毒方高濃度組(F組)、胸腺五肽組(G組)，每組15只，所有大鼠均正常飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境，之后開始造脾虛模型?？瞻讓?duì)照組及空白肝癌模型組大鼠，正常飲食，予生理鹽水(1 ml/100 g體質(zhì)量)每天上午灌胃1次。其余各組大鼠，每天常狀態(tài)下游泳至力竭(沉入水底2～3 s)，隔天禁食(如單數(shù)日上午8時(shí)清空飼料，保留水源，雙數(shù)日后添加足量飼料)，并給予小承氣湯(1 ml/100 g體質(zhì)量)灌胃，每天1次，連續(xù)4周。在造模結(jié)束后立即處死脾虛對(duì)照組(C組)大鼠，并采集血、肝組織標(biāo)本[13，14]。

1.2.2 肝癌模型脾虛模型結(jié)束后，在此基礎(chǔ)上制作肝癌模型。用Walker-256瘤株(濃度約100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml)用無(wú)菌注射器抽取0.5 ml接種在BALB/c裸鼠頸部、背部皮下，待裸鼠皮下腫瘤長(zhǎng)到直徑約1.0～1.5 cm時(shí)切取腫瘤，在含有Hank’s液中，去除腫瘤中心壞死組織，分割成1 mm3小塊。大鼠經(jīng)吸入丙泊酚麻醉后，局部常規(guī)消毒，行劍突下腹中線縱行1 cm切口，暴露肝臟，取瘤組織1塊，在離體30 min內(nèi)用粗針頭植入大鼠肝葉深部實(shí)質(zhì)，觀察片刻，并壓迫止血后全層關(guān)腹[15，16]。肝癌大鼠基本狀態(tài)指標(biāo)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 肝癌大鼠基本狀態(tài)指標(biāo)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 Western-blot檢測(cè)TCR和ERK1/2，p-ERK1/2蛋白肝癌模型每組選取存活時(shí)間較長(zhǎng)的大鼠3只，獲取無(wú)癌腫侵襲的肝組織和無(wú)壞死肝癌組織及外周T淋巴細(xì)胞；非肝癌模型每組3只大鼠，選取色質(zhì)良好的肝組織及外周T淋巴細(xì)胞。取肝組織、肝癌組織、T淋巴細(xì)胞，提取蛋白，配膠，蛋白加樣，制備凝膠，上樣電泳。轉(zhuǎn)膜。室溫封閉。TBST洗膜。孵育一抗,孵育過夜。孵育二抗，孵育1 h左右，顯色試劑盒顯色，曝光，顯影和定影。運(yùn)用軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值的半定量分析。相對(duì)光密度計(jì)算方法：目標(biāo)條帶積分光密度÷內(nèi)參積分光密度(GADPH)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Log Rank (Mantel-Cox)進(jìn)行累積生存率分析，正態(tài)計(jì)量資料采用單因素方差分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 健脾解毒對(duì)脾虛肝癌大鼠生存狀態(tài)的影響

2.1.1 健脾解毒方對(duì)脾虛肝癌大鼠惡液質(zhì)積分的影響中藥高濃度組及胸腺五肽組大鼠惡液質(zhì)積分明顯低于脾虛肝癌模型組大鼠，且中藥高濃度組大鼠惡液質(zhì)積分也低于中藥低濃度組。見表2。

2.1.2 健脾解毒方對(duì)脾虛肝癌大鼠體重的影響見表3。

表2 健脾解毒方對(duì)脾虛肝癌大鼠惡液質(zhì)積分的影響 (例，

注：?jiǎn)我蛩胤讲罘治觯瑦阂嘿|(zhì)積分F=5.304，P=0.001；與健脾解毒方高濃度組比較，1)P<0.01，2)P<0.05；與胸腺五肽組比較，3)P<0.01，4)P<0.05

表3 健脾解毒方對(duì)脾虛肝癌大鼠體重的影響 (例，

注：?jiǎn)我蛩胤讲罘治觯航K末期體重：F=3.756，P<0.01；與健脾解毒方高濃度組比較，1)P<0.01，2)P<0.05；與胸腺五肽組比較，3)P<0.01，4)P<0.05

2.1.3 健脾解毒方對(duì)脾虛肝癌大鼠累積生存率的影響健脾解毒方高濃度組大鼠生存率與胸腺肽組相當(dāng)(P=0.49)，高于肝癌模型組及脾虛肝癌模型組(P<0.01)。且健脾解毒方高濃度組大鼠生存率明顯高于健脾解毒方低濃度組(P=0.04)。見表4。

表4 健脾解毒方對(duì)脾虛肝癌大鼠累積生存率的影響

注：Log-Rank檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量=34.094，v=4,P=0.00

2.2 各模型組實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)

2.2.1 Western Blot檢測(cè)肝組織、癌組織中TCR蛋白的表達(dá)水平見圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)肝組織、癌組織中TCR蛋白的表達(dá)

2.2.2 Western Blot半定量分析肝組織、癌組織中TCR蛋白的表達(dá)水平肝癌模型組(B組)與脾虛肝癌模型組(D組)大鼠肝組織中，TCR蛋白表達(dá)量較空白對(duì)照組(A組)和脾虛對(duì)照組(C組)明顯增加 (P<0.05)。健脾解毒方高濃度組(F組)大鼠肝組織、癌組織中TCR蛋白表達(dá)量均明顯高于脾虛肝癌模型組(D組)(P<0.05)。健脾解毒方低濃度組(E組)大鼠肝組織中TCR蛋白表達(dá)量明顯高于脾虛肝癌模型組(D組)(P<0.05)。胸腺五肽組(G組)肝組織中TCR蛋白表達(dá)量明顯高于脾虛肝癌模型組(D組)(P<0.05)。見圖2。

圖2 Western blot半定量分析肝組織、癌組織中TCR蛋白的表達(dá)水平

2.2.3 Western Blot檢測(cè)T淋巴細(xì)胞TCR蛋白表達(dá)水平見圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)T淋巴細(xì)胞中TCR蛋白的表達(dá)

2.2.4 Western Blot半定量分析T淋巴細(xì)胞中TCR蛋白的表達(dá)水平脾虛對(duì)照組(C組)大鼠T淋巴細(xì)胞中TCR蛋白表達(dá)量高于空白對(duì)照組(A組)(P<0.05)。肝癌模型組(B組)與脾虛肝癌模型組(D組)大鼠T淋巴細(xì)胞中TCR蛋白表達(dá)量均低于空白對(duì)照組(A組)與脾虛對(duì)照組(C組)(P<0.05)。健脾解毒方高濃度組(F組)大鼠T淋巴細(xì)胞中TCR蛋白表達(dá)量>健脾解毒方低濃度組(E組)>脾虛肝癌模型組(D組)(P<0.05)。見圖4。

圖4 Western blot半定量分析T淋巴細(xì)胞中TCR蛋白的表達(dá)

2.2.5 Western Blot檢測(cè)T淋巴細(xì)胞ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平見圖5。

圖5 Western blot檢測(cè)T淋巴細(xì)胞中ERK1/2及p-ERK1/2蛋白的表達(dá)

2.2.6 Western Blot半定量分析T淋巴細(xì)胞中ERK1/2及p-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平肝癌模型組(B組)與脾虛肝癌模型組(D組)大鼠T淋巴細(xì)胞中ERK1/2蛋白表達(dá)量均低于空白對(duì)照組(A組)與脾虛對(duì)照組(C組)(P<0.05)。健脾解毒方高濃度組(F組)大鼠T淋巴細(xì)胞中ERK1/2蛋白表達(dá)量>脾虛肝癌模型組(D組)(P<0.05)。肝癌模型組(B組)與脾虛肝癌模型組(D組)大鼠T淋巴細(xì)胞中p-ERK1/2蛋白表達(dá)量均低于空白對(duì)照組(A組)與脾虛對(duì)照組(C組)(P<0.05)。健脾解毒方高濃度組(F組)大鼠T淋巴細(xì)胞中p-ERK1/2蛋白表達(dá)量>健脾解毒方低濃度組(E組)>脾虛肝癌模型組(D組)(P<0.05)。見圖6。

圖6 Western blot半定量分析T淋巴細(xì)胞中ERK1/2及p-ERK1/2蛋白的表達(dá)

3 討論

本研究中，大鼠在接種肝癌后，出現(xiàn)進(jìn)食進(jìn)水量明顯減少，體質(zhì)量明顯下降、精神倦怠、疲乏無(wú)力、活動(dòng)量減少等惡液質(zhì)表現(xiàn)。健脾解毒方高濃度組大鼠的惡液質(zhì)積分明顯低于肝癌模型組及脾虛肝癌模型組(P<0.05)。且健脾解毒方高濃度組大鼠生存時(shí)間，術(shù)后第14天體重及終末體質(zhì)量明顯優(yōu)于肝癌模型組及脾虛肝癌模型組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高濃度的健脾解毒方能明顯地對(duì)抗移植瘤導(dǎo)致的惡液質(zhì)的發(fā)生和進(jìn)展，明顯延長(zhǎng)荷瘤鼠的生存時(shí)間。

本方立足于肝癌機(jī)體肝郁脾虛、瘀毒內(nèi)結(jié)的基本病機(jī),本研究采用Wistar大鼠在成功造脾虛的基礎(chǔ)上，制作Walk-256肝癌移植模型。脾氣虧虛，運(yùn)化無(wú)力，導(dǎo)致痰、瘀、毒互結(jié)，肝膽疏泄失常，病邪郁積肝臟。與機(jī)體免疫失調(diào)，最終罹患肝癌的基本病機(jī)相似。機(jī)體的免疫功能受損，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視和殺傷功能下降，腫瘤迅速發(fā)展。

由于免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)是免疫識(shí)別，沒有免疫識(shí)別，細(xì)胞免疫就無(wú)法激活，以致免疫應(yīng)答、免疫監(jiān)視、免疫防御功能受到抑制，細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制[5]等都可能受到影響。T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor)是T細(xì)胞表面關(guān)鍵的受體分子，與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)，T細(xì)胞通過特異性的TCR識(shí)別腫瘤抗原。已有文獻(xiàn)報(bào)道[5]，實(shí)體瘤患者T淋巴細(xì)胞的TCR出現(xiàn)限制性利用，多態(tài)性遭到破壞，其對(duì)腫瘤抗原親和力相對(duì)較低，直接影響后續(xù)T細(xì)胞的活化，導(dǎo)致T細(xì)胞功能的免疫功能失調(diào)。

特性TCR具有識(shí)別腫瘤抗原能力，并活化T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路是經(jīng)典的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，許多研究表明[9～12]，ERK1/2信號(hào)通路的激活能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化、增殖，并抑制T淋巴細(xì)胞的凋亡。

我們的研究表明，接種肝移植瘤后，空白肝癌模型組與脾虛肝癌模型組大鼠外周T淋巴細(xì)胞中TCR蛋白、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白表達(dá)量較空白對(duì)照組及脾虛對(duì)照組均明顯降低。其機(jī)制可能是移植瘤造肝癌模型后，會(huì)導(dǎo)致大鼠T細(xì)胞中某一或某些亞家族的TCR出現(xiàn)沉默或低表達(dá)，TCR多態(tài)性遭到破壞，T細(xì)胞的活化相應(yīng)減少。在肝組織中，肝癌模型組與脾虛肝癌模型組大鼠TCR蛋白表達(dá)量分別要高于空白對(duì)照組及脾虛對(duì)照組，可能是因?yàn)橐浦哺伟┖?，肝組織中特異性TCR識(shí)別腫瘤，TCR出現(xiàn)克隆性增殖，以達(dá)到局部抗腫瘤的作用。

高濃度健脾解毒方干預(yù)脾虛肝癌大鼠后，肝組織、癌組織中TCR蛋白表達(dá)量出現(xiàn)明顯增加，且外周T淋巴細(xì)胞中TCR蛋白、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白表達(dá)量均出現(xiàn)明顯增加，可能說(shuō)明高濃度健脾解毒方(37.5 g/kg)能夠一定程度上恢復(fù)TCR多態(tài)性，促進(jìn)特異性TCR識(shí)別腫瘤抗原，改善免疫微環(huán)境，增加特異性T淋巴細(xì)胞活性、增殖，發(fā)揮抗腫瘤的免疫作用，以達(dá)到對(duì)抗腫瘤導(dǎo)致的惡液質(zhì)的發(fā)生和進(jìn)展，延長(zhǎng)脾虛肝癌大鼠的生存時(shí)間的目的。

研究表明，胸腺五肽組大鼠在移植瘤術(shù)后第14天及終末期體質(zhì)量、累積生存率明顯高于肝癌模型組及脾虛肝癌模型組，且惡液質(zhì)積分更低。胸腺肽組大鼠肝組織、外周T淋巴細(xì)胞中TCR蛋白表達(dá)量明顯高于脾虛肝癌模型組，但其癌組織中TCR蛋白表達(dá)量，T淋巴細(xì)胞中ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白表達(dá)量均與脾虛肝癌模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明胸腺五肽可改善移植瘤大鼠生存狀態(tài)，延長(zhǎng)荷瘤鼠生存時(shí)間，但其作用機(jī)理可能與TCR、ERK1/2信號(hào)通路無(wú)明顯相關(guān)性。