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        健脾補(bǔ)血顆粒微生物限度檢查方法的驗(yàn)證

        2019-06-29 08:28:18孫乃霞郭社民
        光明中醫(yī) 2019年12期

        孫乃霞 郭社民

        藥品的檢查項(xiàng)目中,微生物限度檢查是一項(xiàng)重要的指標(biāo),為了使檢驗(yàn)方法更合理,更能真實(shí)地考察藥物的微生物污染情況,國家藥典委員會也不斷地完善微生物檢查法。該法2015年版《中華人民共和國藥典》收載的方法較之前的版本變化較大,比如培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法、培養(yǎng)條件等方面,所以為了檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠,樣品檢驗(yàn)時需要重新建立合適的檢驗(yàn)方法[1,2]。健脾補(bǔ)血顆粒是比較常見、應(yīng)用也比較廣泛的中藥制劑,它收載在《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第十七冊中。相關(guān)組份有皂礬、黨參、茯苓、黑豆(炒)、神曲茶、甘草、白術(shù)、陳皮等,功能主治為各種類型的貧血,也能和胃、健脾、助消化。本文依照《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定的檢驗(yàn)方法對健脾補(bǔ)血顆粒微生物限度檢查方法進(jìn)行試驗(yàn),尋找合適的檢驗(yàn)方法,不僅使本樣品檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠,也希望能對藥品生產(chǎn)企業(yè)和檢驗(yàn)監(jiān)督機(jī)構(gòu)提供一些參考。

        1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1 儀器設(shè)備電熱恒溫培養(yǎng)(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠,型號:HHBII500-S、揚(yáng)州慧科電子有限公司,型號:GHP-9162)、生化培養(yǎng)箱(揚(yáng)州慧科電子有限公司,型號:SPX-150)、立式滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠,型號:YXQ-LS-50SII)、生物安全柜(蘇凈集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司,型號:BSC-1600IIA2、電子天平(福州華志科學(xué)儀器有限公司,型號:HZF-AE200)。

        1.2 培養(yǎng)基胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號:20170607)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號:20170218)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號:20170525)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號:20170605)、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基(批號:20170603)、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號:20171200)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號:20180220)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號:20171212)、RV沙門增菌液體培養(yǎng)基(批號:20180402)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(批號:20180623)、三糖鐵瓊脂(批號:20180620)。生產(chǎn)廠家:青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。以上培養(yǎng)基的適用性試驗(yàn)均符合現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》規(guī)定。

        1.3 試驗(yàn)樣品健脾補(bǔ)血顆粒廠家:河南華峰制藥有限公司,批號:20180401(1號)、20180402(2號)、20180403(3號)。

        1.4 試驗(yàn)菌大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50094]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、黑曲霉菌[CMCC(F)98003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001],購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 菌液的制備金黃色葡萄球菌菌懸液的制備:Ⅰ將金黃色葡萄球菌接種到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,33℃培養(yǎng)20 h,取該培養(yǎng)物適量;Ⅱ用0.9%的無菌氯化鈉溶液配制成菌懸液,再用0.9%的氯化鈉溶液分步稀釋,選取1 ml的含菌量不超過100 cfu的菌懸液備用。枯草芽孢桿菌菌懸液的制備:將枯草芽孢桿菌接種到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,33℃培養(yǎng)20 h,取該培養(yǎng)物適量,余下配制方法同上述Ⅱ的操作。銅綠假單胞菌菌懸液的制備:將銅綠假單胞菌接種到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,33℃培養(yǎng)20 h,取該培養(yǎng)物適量,余下配制方法同上述Ⅱ的操作。黑曲霉菌懸液的制備:將黑曲霉菌接種到沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上,23℃培養(yǎng)6 d,加0.9%無菌氯化鈉溶液5 ml,洗脫孢子,制成孢子懸液。取孢子懸液適量,余下配制方法同上述Ⅱ的操作。白色念珠菌菌懸液的制備:將白色念珠菌接種到沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中,23℃培養(yǎng)2 d,取該培養(yǎng)物適量,余下配制方法同上述Ⅱ的操作。大腸埃希菌菌懸液的制備:將大腸埃希菌接種到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,33℃培養(yǎng)20 h,取該培養(yǎng)物適量,余下配制方法同上述Ⅱ的操作。沙門菌菌懸液的制備:將沙門菌接種到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,33℃培養(yǎng)20 h,取該培養(yǎng)物適量,余下配制方法同上述Ⅱ的操作。

        2.2 供試液的制備與稀釋取樣品1號、2號、3號,各稱取10 g分別置于3個勻漿杯中,各加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 ml作為稀釋液,混勻,制成稀釋濃度為1∶10溶液。取上述溶液適量,分別用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基分步稀釋,將三批樣品均依次制成1∶50、1∶100、1∶1000的供試液備用。

        2.3 微生物回收試驗(yàn)用供試液的制備試驗(yàn)組:取2.2項(xiàng)制備的三批樣品的4個不同濃度供試液各100 ml,加入2.1項(xiàng)配制的相關(guān)菌液各1 ml,混勻備用。供試品對照組:取2.2項(xiàng)制備的三批樣品的4個不同濃度供試液各100 ml,加入稀釋液代替菌液,與試驗(yàn)組平行操作,混勻備用。菌液對照組:取稀釋液各100 ml代替供試品,分別加入2.1項(xiàng)配制的相關(guān)菌液各1 ml,與試驗(yàn)組平行操作,混勻備用。

        2.4 供試品中微生物回收(平皿-傾注法)取2.3項(xiàng)制備的三批樣品的試驗(yàn)組、供試品對照組、菌液對照組各2 ml,注入2個平皿,一個平皿1 ml,傾注相應(yīng)的培養(yǎng)基(溫度不超過45℃),搖勻,待凝固后倒置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板為33℃培養(yǎng)3 d,沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板為23℃培養(yǎng)5 d。觀察,計數(shù)。

        2.5 計算回收比值計算方法:試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù),所得差值除以菌液對照組的平均菌落數(shù)。見表1、表2。

        表1 需氧菌驗(yàn)證回收率

        表2 霉菌和酵母菌驗(yàn)證回收率

        2.6 計數(shù)方法的確立根據(jù)規(guī)定,比值應(yīng)在0.5~2 范圍內(nèi)[3]。觀察表1:三批樣品均是稀釋級別為1∶100時,胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)的5種試驗(yàn)菌株的回收率都符合規(guī)定;觀察表2:稀釋級別在1∶10時,沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)的2種菌株的回收率都符合規(guī)定。所以健脾補(bǔ)血顆粒需氧菌總數(shù)計數(shù)檢查是應(yīng)選擇最低稀釋級別為1∶100的平皿傾注法;而霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)檢查則宜選取最低稀釋級別為1∶10的供試液的平皿傾注法。

        2.7 控制菌檢驗(yàn)方法適應(yīng)性試驗(yàn)

        2.7.1 大腸埃希菌實(shí)驗(yàn)步驟以一批樣品敘述,其余兩批同法試驗(yàn)(下同)。取2.2中制備的1∶10的供試液30 ml,分別接種至3份各含100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中,每瓶10 ml供試液。其中瓶1加入2.1中制備的大腸埃希菌菌懸液1 ml,作為試驗(yàn)組;瓶2加入2.1中制備的金黃色葡萄球菌菌懸液1 ml,作為陰性菌對照組;瓶3為供試品組。將上述培養(yǎng)液混勻,33℃培養(yǎng)20 h后,分別將上述培養(yǎng)物接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中,接種量為1 ml。43℃培養(yǎng)30 h后,將麥康凱液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)物用接種環(huán)劃線接種在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上,33℃培養(yǎng)68 h,觀察,根據(jù)上述3組對應(yīng)平板的菌落生長情況,判斷該法是否可行。

        2.7.2 耐膽鹽革蘭陰性菌取2.2中制備的1∶10的供試液10 ml,置23℃培養(yǎng)2 h,使其中的細(xì)菌充分恢復(fù)。取供試液4 ml,分別接種至4支盛有10 ml腸道菌增菌液體培養(yǎng)基的試管中,每支1 ml供試液,其中管1加入2.1中制備的大腸埃希菌菌懸液1 ml作為試驗(yàn)組a;管2加入2.1中制備的銅綠假單胞菌菌懸液1 ml為試驗(yàn)組b;管3加入2.1中制備的金黃色葡萄球菌菌懸液1 ml為陰性菌對照組;管4為供試品組。將4管置33℃培養(yǎng)38 h,然后劃線接種在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上,置33℃培養(yǎng)22 h。觀察,根據(jù)4組對應(yīng)平板上菌落生長情況,判斷該法是否可行。

        2.7.3 沙門菌取樣品30 g,分別接種于3瓶含胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 ml的三角瓶中,每瓶樣品10 g,混勻,其中瓶1加入2.1中制備的沙門菌菌懸液1 ml作為試驗(yàn)組;瓶2加入2.1中制備的金黃色葡萄球菌菌懸液為陰性菌對照組;瓶3為供試品組。將各組混勻,33℃培養(yǎng)22 h。將3組培養(yǎng)物各取0.1 ml,分別接種至含10 ml RV沙門增菌液體培養(yǎng)基的試管中,33℃培養(yǎng)22 h。取RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物用接種環(huán)接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板之上,置33℃培養(yǎng)45 h。觀察,根據(jù)3組對應(yīng)平板上的菌落生長情況,判斷該法是否可行。

        2.7.4 大腸埃希菌試驗(yàn)結(jié)果三批樣品中:加入陽性菌的試驗(yàn)組經(jīng)過培養(yǎng),平板上均有菌生長,且經(jīng)鑒定,該菌即為所加陽性菌;而加入陰性對照菌的一組和供試品一組經(jīng)培養(yǎng),平板上均未見有菌生長,說明本次試驗(yàn)建立的常規(guī)法對大腸埃希菌的選擇性很好,此法可行,可用于該項(xiàng)目的檢驗(yàn)。見表3。

        表3 大腸埃希菌試驗(yàn)結(jié)果

        2.7.5 耐膽鹽革蘭陰性菌試驗(yàn)結(jié)果3批樣品中,加入陽性菌的2個試驗(yàn)組a、b經(jīng)過培養(yǎng),平板上均有菌生長,且經(jīng)鑒定,該菌即為所加陽性菌;而加入陰性對照菌的一組和供試品一組經(jīng)培養(yǎng),平板上均未見有菌生長,說明本次試驗(yàn)建立的常規(guī)法對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的選擇性都良好,此法可行,可用于該項(xiàng)目的檢驗(yàn)。見表4。

        表4 耐膽鹽革蘭陰性菌試驗(yàn)結(jié)果

        2.7.6 沙門菌試驗(yàn)結(jié)果三批樣品中:加入陽性菌的試驗(yàn)組經(jīng)過培養(yǎng),平板上均有菌生長,且經(jīng)鑒定,該菌即為所加陽性菌;而加入陰性對照菌的一組和供試品一組經(jīng)培養(yǎng),平板上均未見有菌生長,說明本次試驗(yàn)建立的常規(guī)法對沙門菌的選擇性很好,此法可行,可用于該項(xiàng)目的檢驗(yàn)。見表5。

        表5 沙門菌試驗(yàn)結(jié)果

        3 討論

        微生物限度檢查法是從《中華人民共和國藥典》2005年版開始引入方法驗(yàn)證試驗(yàn)[4],方法驗(yàn)證的提出,使檢驗(yàn)更有邏輯性,也使檢驗(yàn)結(jié)果更加真實(shí)可靠。近十幾年來,中國藥典委員會不斷對方法驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行改進(jìn)、完善,相對于前版來說,現(xiàn)行《藥典》在非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查部分,變動較大,為了確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,檢驗(yàn)方法都需要重新驗(yàn)證[5]。

        本樣品是顆粒劑,通常顆粒劑是經(jīng)過提取,檢驗(yàn)時相對來說影響因素較少,干擾因素也少,可本樣品不同,為了使菌落能更好的生長,本文選擇了胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋液[6]。

        為了更方便計數(shù),檢查需氧菌總數(shù)計數(shù)時可以用陶瓦蓋代替平皿的玻璃蓋[7]。

        本版《藥典》在控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)中首次提出了陰性菌對照,同供試品檢查方法中的陰性對照不同,陰性對照菌更加體現(xiàn)了培養(yǎng)體系的專屬性,也使檢驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠[8]。

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