石 崗，劉 刁，馮韶華，李 尚，張正敏，周一彤，施文影，安亞輝，曹洪戰(zhàn)

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北 保定 071000）

在生物學(xué)家和相關(guān)從業(yè)人員的共同努力之下，生物學(xué)的研究內(nèi)容日漸豐富，生物學(xué)分析包括基因組學(xué)、全基因組學(xué)、生物信息學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等，致力于從組織、細(xì)胞、DNA、RNA等多個層次和水平研究生物組織或者細(xì)胞在某一階段的狀態(tài)。其中，RNA是生物遺傳信息的主要傳遞者，一般位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，部分RNA具有酶活性且參與基因表達(dá)調(diào)控，因此比較研究同一或不同組織之間的不同表型或不同發(fā)育階段的RNA表達(dá)豐度，進(jìn)行了解基因的結(jié)構(gòu)和功能是轉(zhuǎn)錄組學(xué)的主要內(nèi)容[1]。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展提高了測序樣品的準(zhǔn)確性，也促進(jìn)了利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)對豬等畜種的研究。大白豬和長白豬等國外引進(jìn)豬種與萊蕪豬、沙子嶺豬和金華豬等中國地方豬種在生產(chǎn)性能方面存在差異，研究證明這種種質(zhì)差異與基因的差異表達(dá)有關(guān)，因此從轉(zhuǎn)錄組水平研究性狀差異表達(dá)基因，有助于分析和揭示品種間差異及其差異機理。利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對豬的肉質(zhì)性狀、分析豬胚胎附植的中期和后期卵巢差異表達(dá)基因等方面已經(jīng)取得了一定的研究進(jìn)展。

1 轉(zhuǎn)錄組測序的相關(guān)概念

1.1 轉(zhuǎn)錄組

轉(zhuǎn)錄組在廣義上是指某個物種、特定組織或特定細(xì)胞在某一發(fā)育階段或者功能狀態(tài)下產(chǎn)生的所有RNA的總和，包括信使RNA（mRNA）和非編碼RNA[2-3]，目前研究較多的非編碼RNA又包括環(huán)狀RNA（circRNA），小RNA（miRNAs）及長鏈非編碼RNA（lncRNAs）等。在狹義上是指所有mRNA的集合。因為蛋白質(zhì)是最直接地描述細(xì)胞功能和狀態(tài)，所以轉(zhuǎn)錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，揭示特定生物學(xué)過程以及疾病發(fā)生過程中的分子機理。目前轉(zhuǎn)錄組研究已經(jīng)廣泛運用于基礎(chǔ)研究、疾病診斷和新藥物研發(fā)等研究領(lǐng)域。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序

轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）是建立在新一代測序技術(shù)基礎(chǔ)之上的一種對轉(zhuǎn)錄組分析的測序技術(shù)，指利用第二代高通量測序技術(shù)進(jìn)行與某RNA鏈呈互補堿基序列的DNA（cDNA）測序，全面快速地獲取某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本信息。

2 轉(zhuǎn)錄組測序的平臺

隨著生物學(xué)技術(shù)和測序技術(shù)的發(fā)展，目前的測序技術(shù)主要有三種，分別是Roche公司的454 FLX焦磷酸測序平臺、Illumina公司的Solexa基因組分析平臺和ABI公司的SOLiD，表1是對這三大測序平臺的比較。

除了第二代測序技術(shù)外，最近兩三年還研發(fā)出了第三代測序技術(shù)，主要包括太平洋生物科學(xué)公司研發(fā)的PacBio RS平臺、全基因組學(xué)公司研發(fā)的GeXP遺傳分析系統(tǒng)、Ion Torrent/生命技術(shù)公司研發(fā)的個人基因組測序儀（PGM）、牛津納米孔公司研發(fā)的 gridION（納米單分子測序技術(shù)）。與前兩代測序技術(shù)相比，第三代測序技術(shù)的最大特點是單分子測序，測序過程無需PCR擴增。值得提出的是，牛津納米孔公司研發(fā)的納米單分子測序技術(shù)與以往的測序技術(shù)均不同，它是基于電信號的測序技術(shù)[6]，優(yōu)勢包括讀長很長，大約在幾十kb甚至上百kb；錯誤率極低，而且是隨機錯誤；樣品制備簡單而且成本低。

目前還有一種基于半導(dǎo)體芯片的新一代革命性測序技術(shù)——Ion Torrent6[7]，是由Jonathan Rothberg發(fā)明的。該技術(shù)使用了一種布滿小孔的高密度半導(dǎo)體芯片， 一個小孔就是一個測序反應(yīng)池。該技術(shù)的成本相對來說較低，體積也較小，同時操作也要更為簡單，速度也相當(dāng)快速。雖然整個芯片的通量不高，但很適合小基因組和外顯子驗證的測序。總之，測序技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展不斷提高著測序的準(zhǔn)確性、便利性和靈敏性，同時降低著測序成本，為生物信息學(xué)、蛋白組學(xué)、基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等生物學(xué)研究創(chuàng)造有利條件。

表1 三大轉(zhuǎn)錄組測序平臺的比較

3 轉(zhuǎn)錄組分析的一般流程

轉(zhuǎn)錄組分析的一般流程和技術(shù)路線為。

1）總RNA提?。焊鶕?jù)不同的樣品類型采用不同的提取方案，獲得高質(zhì)量的總RNA；

2）RNA質(zhì)量檢測：Nanodrop檢測RNA樣品濃度及純度；瓊脂糖凝膠電泳及Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA樣品完整性；

3）rRNA去除：針對不同物種選擇合適的rRNA去除試劑盒去除樣品中的rRNA；

4）RNA片段化：采用mg2+離子打斷的方法，將RNA片段化至200～300bp；

5）cDNA合成：隨機引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；在合成cDNA第二鏈時摻入dUTP標(biāo)記第二鏈，保留了RNA的鏈方向性；

6）加A尾，接頭連接：cDNA兩端引入接頭序列及標(biāo)記樣品的index序列；

7）PCR富集：PCR富集文庫片段；

8）文庫質(zhì)檢：檢測文庫大小分布和測定文庫濃度；

9）上機測序：根據(jù)數(shù)據(jù)量要求將文庫pooling上機測序；

10）數(shù)據(jù)分析：包括原始數(shù)據(jù)質(zhì)控檢查、circRNA差異分析等基礎(chǔ)分析和基于基因表達(dá)的通路活性分析、差異長鏈非編碼RNA的調(diào)控基因的通路富集分析等高級分析。

4 基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在豬上的研究進(jìn)展

4.1 基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對豬肉質(zhì)性狀方面的研究

國內(nèi)外已經(jīng)有很多利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對中國地方豬和國外品種在肉質(zhì)等性狀進(jìn)行差異表達(dá)分析，取得了很大的研究成果。已有利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在德保豬、北京黑豬、萊蕪豬和沙子嶺豬等地方豬肉質(zhì)性狀方面的研究，Wu等[8]以30、90、150日齡的金華豬和長白豬為試驗動物，比較分析背最長肌轉(zhuǎn)錄譜，分別在金華豬發(fā)現(xiàn)了促進(jìn)脂肪合成的基因（FASN和SCD等）和長白豬中發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)肌肉生成的基因（Myf6和Foxo1）。李青芝等[9]以長白豬的背部皮下脂肪與內(nèi)臟脂肪為試驗樣本，通過轉(zhuǎn)錄組測序比較分析，在背部皮下脂肪、大網(wǎng)膜和腸系膜中發(fā)現(xiàn)了不同數(shù)量的轉(zhuǎn)錄本，證明在不同的部位，脂肪組織轉(zhuǎn)錄本具有明顯的組織特異性表達(dá)模式。Yu等[10]比較了藍(lán)塘豬和長白豬背最長肌脂肪酸組成，發(fā)現(xiàn)藍(lán)塘豬單不飽和脂肪酸（MUFA）比率較低，而多不飽和脂肪酸（PUFA）比率較高，與長白豬具有顯著性差異；Corominas等[11]采 用RNA高通量測序技術(shù)同樣發(fā)現(xiàn)在MUFA含量高的群體中，其脂肪酸合成基因表達(dá)量較低。Puig-Oliveras等[12]對同一群體的背最長肌轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了18個與肌內(nèi)脂肪（IMF）沉積相關(guān)的差異表達(dá)基因，而且當(dāng)肌肉中的脂肪酸沉積存在差異時，脂肪酸脂質(zhì)代謝也被不同地調(diào)節(jié)。Yuding Wang等[13]利用動態(tài)轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化分析技術(shù)研究影響豬背最長肌中肌內(nèi)脂肪含量的基因，共檢測到22 524個表達(dá)基因，其中有1 158個差異表達(dá)基因，并且檢測到與脂肪合成有關(guān)的基因，如FASN，PVALB，ID2，SH3PXD2B和EGR1等。

這些研究結(jié)果表明存在影響豬肉質(zhì)性狀的基因，且在不同豬品種中，影響豬脂肪酸、脂肪沉積和脂肪合成等的基因存在差異，同一基因在不同豬種中的表達(dá)量也存在差異，有助于篩選到影響某一品種肉質(zhì)性狀的特異基因，從而可以啟發(fā)育種工作者利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究中國地方豬種肉質(zhì)性狀的特異基因，再將這些基因利用分子育種運用到實際生產(chǎn)中，提高豬肉品質(zhì)，打造獨特的地方品種和豬肉品牌。

4.2 基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對豬骨骼肌差異表達(dá)的研究

國外引進(jìn)豬種生長速度快但肉質(zhì)較差，而我國地方豬肉質(zhì)優(yōu)良但生長速度慢，造成這種差異的原因是基因的差異表達(dá)。已有利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)探索中外豬種骨骼肌差異表達(dá)基因的研究報道。隨著芯片技術(shù)和高通量技術(shù)發(fā)展，越來越多的與骨骼肌相關(guān)的mRNA被發(fā)現(xiàn)。Huang等[14]分別對豬胚胎及成年豬骨骼肌進(jìn)行miRNA同源性分析及表達(dá)譜，檢測出了140個差異表達(dá)的miRNA。McDaneld等[15]用同樣的方法檢測到了12個與骨骼肌相關(guān)的miRNA。Nielsen等[16]利用二代基因測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了212個與骨骼肌相關(guān)的、高表達(dá)的miRNA，可能與骨骼發(fā)育與再生有關(guān)。陳偉[17]利用RNA-seq技術(shù)對萊蕪豬與大白豬骨骼肌文庫進(jìn)行測序來研究轉(zhuǎn)錄譜，發(fā)現(xiàn)在骨骼肌中存在178個顯著差異表達(dá)的基因。目前，一些骨骼肌差異表達(dá)基因和基因家族已經(jīng)被檢測到的有肌生成調(diào)控因子(MRFs)家族、肌肉生長抑制素(MSTN)和Pax基因家族，這些基因家族的鑒定及其分子遺傳機制的闡明可以幫助人們分析影響豬種間性狀差異的原因。通過轉(zhuǎn)錄組分析可以比較分析地方豬和國外豬種背最長肌miRNA轉(zhuǎn)錄組，并篩選出差異表達(dá)的miRNA和mRNA，進(jìn)而從轉(zhuǎn)錄組水平探究影響背最長肌差異表達(dá)的分子機制。隨著測序技術(shù)的發(fā)展和研究內(nèi)容的深入，相信這種分子機制將會越來越明確。

4.3 基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對豬胚胎附植的研究

胚胎附植可以通過影響母豬胚胎數(shù)進(jìn)而影響母豬的產(chǎn)仔數(shù)，產(chǎn)仔數(shù)也是母豬重要的繁殖性狀之一。如果能夠找到影響母豬胚胎附植的關(guān)鍵調(diào)控基因，有助于提高產(chǎn)仔數(shù)。要研究胚胎附植就需要找到這一繁殖活動的關(guān)鍵調(diào)控基因，RNA-seq技術(shù)為這一研究提供了可能[18]，也有一些研究期望通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)影響胚胎附植的基因，但涉及的研究報道不多，付言峰及其團隊在這方面作了一些工作。該團隊研究了胚胎附植期Eph-Ephrin A基因家族在豬子宮內(nèi)膜中的mRNA表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)Eph-Ephrin A的mRNA表達(dá)可能對豬的胚胎附植調(diào)控有一定影響[19]。還利用RNA-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞受體B2（Eph B2）很可能在豬胚胎附植過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[20]。同時該團隊以5～7胎次的梅山豬為試驗動物，采集其卵巢組織進(jìn)行 RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)在卵巢組織表達(dá)的基因，重點參與胚胎附植后期的調(diào)控[21]。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)為研究影響母豬繁殖性狀的調(diào)控基因提供了另一個思路，發(fā)現(xiàn)越來越多調(diào)控基因。如果把這些基因用于標(biāo)記輔助選擇（MAS），能夠提高母豬的繁殖性狀，進(jìn)而提高豬場的經(jīng)濟效益。

5 小結(jié)

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)日漸成為研究家畜相關(guān)性狀的重要方法，發(fā)現(xiàn)越來越多的調(diào)控基因，基因的分子調(diào)控機制的“神秘面紗”也逐漸清晰，這為提高家畜肉質(zhì)性狀、繁殖性狀和生長性狀等性狀提供了基礎(chǔ)。相信在未來，隨著轉(zhuǎn)錄組測序成本的降低和方法的成熟，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)勢必會在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中占有重要的地位。