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        復(fù)合緩釋酸制劑對(duì)豬流行性腹瀉病毒的體外作用研究

        2019-06-29 06:38:46趙勤輝
        豬業(yè)科學(xué) 2019年5期
        關(guān)鍵詞:防控實(shí)驗(yàn)

        趙勤輝

        (意大利亞士可化工大藥廠,上海 200233)

        1 豬流行性腹瀉流行病學(xué)與概況

        豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是一種由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的,以嚴(yán)重的腸炎、腹瀉、嘔吐、脫水和仔豬高死亡率為顯著特征的豬急性高度接觸性腸道傳染病,PEDV主要侵害哺乳仔豬,7日齡以內(nèi)的仔豬死亡率可高達(dá)100%。

        該病于1971年首次在英國被發(fā)現(xiàn),1978年比利時(shí)Pensaert MB教授分離出病原,命名為CV777毒株,我國1978年從上海分離到滬毒株。2010年在我國大面積暴發(fā)PED,造成了數(shù)以千萬計(jì)哺乳仔豬的死亡,2013年又重創(chuàng)了美國養(yǎng)豬業(yè),超過17個(gè)州的養(yǎng)殖場感染了PEDV,造成大量仔豬的死亡。

        2 PEDV基因組結(jié)構(gòu)

        PEDV為單股正鏈RNA病毒,屬于冠狀病毒科,只有一個(gè)血清型,對(duì)外界環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力。PEDV基因組至少有7個(gè)開放閱讀框,基因組長度30 000 kb左右,編碼纖突蛋白(spike protein, S),小包膜蛋白(envelope, E),糖膜蛋白(membrane, M)和核衣殼蛋白(nucleocapsid, N)等4種主要結(jié)構(gòu)蛋白和3種非結(jié)構(gòu)蛋白(復(fù)制酶蛋白1a和1b、ORF3蛋白),其中S蛋白位于病毒粒子外表面,在病毒侵入宿主細(xì)胞和誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過程中發(fā)揮重要作用[1],利用其表面的S蛋白與豬腸道細(xì)胞表面受體結(jié)合,通過膜融合侵入細(xì)胞內(nèi),集中在豬小腸絨毛上皮細(xì)胞中復(fù)制,新生病毒通過糞便和嘔吐物排出體外。PEDV的主要中和抗原位于S基因的1 495-1 914 bp處[2]。

        3 PEDV的傳播方式與特點(diǎn)

        PEDV在37℃條件下最適合的pH是6.5~7.5。據(jù)美國明尼蘇達(dá)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院Dee等研究報(bào)道,PEDV在豆粕粉中可以存活180 d[3]。PEDV可以通過飼料傳播并造成母豬和生長豬發(fā)病[4]。PED主要靠糞口傳播,與發(fā)病豬、帶毒豬直接接觸或者接觸被污染的食物、水、車、人以及環(huán)境、灰塵、氣溶膠也能傳播PEDV。PEDV具有組織嗜性的特點(diǎn),主要侵害腸絨毛上皮細(xì)胞,引起變性、萎縮、脫落。

        4 PED的防控難點(diǎn)

        1)新變異株不斷出現(xiàn),不同毒株之間的交叉保護(hù)率低。

        2)病毒分離困難,有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室分離成功率都只能做到20%~30%。

        3)疫苗免疫效果評(píng)估困難。目前單純的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)血清或者初乳中SIgA并不能與發(fā)病率建立起很好的掛鉤。在實(shí)際生產(chǎn)中經(jīng)??吹?,有些豬場沒打疫苗也不發(fā)生PED,也有許多豬場打了疫苗還發(fā)生PED;有的豬場去年打了疫苗但發(fā)病死亡率高,第二年不打疫苗發(fā)病死亡率卻不高。老板、管理者、獸醫(yī)莫衷一是。

        4)疫苗免疫效果尚待商榷。PEDV主要以腸道局部免疫為主,傳統(tǒng)的活苗抗原滴度有限,致弱后的疫苗毒株在腸道的穩(wěn)定性和增殖能力降低,難于侵入腸道,產(chǎn)生的保護(hù)力有限;滅活苗不能產(chǎn)生有效的黏膜免疫,保護(hù)率偏低。

        5)混合感染居多(PEDV與TGEV、PoRV、PRRSV、PCV2、PRV),增加了防控難度。

        6)返飼是傳統(tǒng)的防控PED的方法,但是存在2個(gè)問題,一是返飼前要做特定病原體的檢測,存在一定的難于預(yù)見的散毒風(fēng)險(xiǎn);二是返飼始終是屬于被動(dòng)的防控,即出了問題之后才去返飼,屬于亡羊補(bǔ)牢型防控。

        7)當(dāng)然行業(yè)內(nèi)也摸索出了一定的防控PED的方式方法,如多點(diǎn)式飼養(yǎng),后備豬進(jìn)群前PEDV活毒馴化,通過實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測后備豬過了排毒期才能進(jìn)種群,活苗與死苗相結(jié)合的接種方法,私制自家苗等,但是總體效果還是不盡如人意。

        所以,PED的防控目前還是行業(yè)內(nèi)的難題之一。決定PED發(fā)病與否的主要是以下幾個(gè)因素:毒量、毒力、腸道菌群與SIgA。所以,降低豬群中的病毒載量,提升豬群腸道健康度以及初乳管理是防控PED的經(jīng)典法則。

        5 酸制劑降低PEDV載量的相關(guān)研究

        美國明尼蘇達(dá)大學(xué)的Trudeau等人研究表明,有機(jī)酸不僅在防控腸道致病細(xì)菌上有效果,對(duì)PEDV等病毒也具有很好的抑制作用,不同商品化酸制劑添加在飼料中對(duì)PEDV具有不同的抑制作用(表1)[5]。

        6 復(fù)合緩釋酸對(duì)PEDV的體外影響研究

        6.1 實(shí)驗(yàn)材料

        Vero細(xì)胞,復(fù)合緩釋酸,AH2012病毒液,反轉(zhuǎn)錄酶,ddH20,探針定量試劑,PEDV抗原檢測試劑盒,DMEM,24孔板,96孔板,胰酶,PBS,恒溫箱等。

        6.2 實(shí)驗(yàn)步驟略

        6.2.1 實(shí)驗(yàn)一:復(fù)合緩釋酸對(duì)PEDV核酸的作用

        1)復(fù)合緩釋酸對(duì)PEDV核酸的作用(37 ℃作用30 min)

        結(jié)果:從組內(nèi)趨勢(shì)看,作用30 min后,隨著復(fù)合緩釋酸的稀釋,病毒含量逐漸增高,1:1 000稀釋后的復(fù)合緩釋酸對(duì)病毒核酸作用不明顯,病毒含量明顯高于其他4組,等體積1:1混合組的PEDV含量最低,表明高濃度復(fù)合緩釋酸可以破壞病毒的核酸,從圖1可看到1:1~1:100稀釋復(fù)合緩釋酸都能夠顯著的破壞病毒核酸。

        2)復(fù)合緩釋酸對(duì)PEDV核酸的作用(37℃作用2 h)

        37℃條件下,復(fù)合緩釋酸病毒與復(fù)合緩釋酸1:1混合和復(fù)合緩釋酸稀釋1:10的梯度都對(duì)病毒的核酸有明顯破壞作用,陰陽性成立,結(jié)果成立,表明37℃作用2 h對(duì)病毒都有破壞作用。

        從圖2可看出,陰陽性成立,復(fù)合緩釋酸和病毒1:1混合作用后,有明顯的破壞病毒核酸的作用。

        6.2.2 實(shí)驗(yàn)二:復(fù)合緩釋酸對(duì)病毒蛋白的作用(37℃,室溫作用2 h)

        圖1 復(fù)合緩釋酸對(duì)PEDV核酸的作用(37 ℃作用30 min)

        圖2 復(fù)合緩釋酸對(duì)PEDV核酸的作用(37 ℃作用2 h)

        表1 不同商品化酸制劑對(duì)飼料中PEDV的抑制作用

        表2 試驗(yàn)結(jié)果

        表3 未過濾與過濾復(fù)合緩釋酸不同稀釋比例的細(xì)胞毒性作用

        圖3 復(fù)合緩釋酸對(duì)病毒蛋白的作用(37 ℃,室溫作用2 h)

        結(jié)果:37 ℃作用2 h后,病毒本身蛋白有所降解,濃度降低,與復(fù)合緩釋酸混合后,同樣發(fā)現(xiàn)1:1和1:10混合對(duì)病毒蛋白有明顯的破壞作用(見圖3)。表明,一定濃度的復(fù)合緩釋酸作用一定時(shí)間對(duì)PEDV病毒蛋白具有破壞作用。

        6.2.3 實(shí)驗(yàn)三:復(fù)合緩釋酸細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

        結(jié)果:從表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,未過濾的復(fù)合緩釋酸稀釋度為1:4導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生病變,對(duì)細(xì)胞有毒性作用;過濾后的復(fù)合緩釋酸稀釋度在1:2對(duì)細(xì)胞有毒性,推測過濾后的復(fù)合緩釋酸可能有損失。表明,小于等于1:8的稀釋比例對(duì)Vero細(xì)胞都不會(huì)產(chǎn)生毒性細(xì)胞病變。

        6.2.4 實(shí)驗(yàn)四:復(fù)合緩釋酸對(duì)PEDV致病性作用(TCID50)

        結(jié)果:1)可看到復(fù)合緩釋酸原液與病毒等比例稀釋,不論作用多久,病毒完全不產(chǎn)生病變,對(duì)病毒致病性有完全殺滅作用;

        2)復(fù)合緩釋酸稀釋 1:2,1:4,1:8且在作用15 min,30 min對(duì)病毒有輕微的滅毒作用,作用1 h 則可起到大部分殺滅作用(見表4),說明作用時(shí)間長短對(duì)殺滅總用是有影響的,但總體來說,復(fù)合緩釋酸對(duì)病毒有較好的殺滅作用。

        實(shí)驗(yàn)表明,一定濃度的復(fù)合緩釋酸作用PEDV一段時(shí)間后,會(huì)使PEDV失去感染細(xì)胞和產(chǎn)生細(xì)胞病變的能力。

        圖4 復(fù)合緩釋酸對(duì)PEDV復(fù)制的影響

        表4 復(fù)合緩釋酸不同稀釋比例對(duì)病毒產(chǎn)生細(xì)胞病變能力的影響

        6.2.5 實(shí)驗(yàn)5:復(fù)合緩釋酸對(duì)PEDV復(fù)制的影響(病毒拷貝數(shù))

        結(jié)果:現(xiàn)象觀察發(fā)現(xiàn)1:4組無病變,1:8有輕微病變,1:16局部出現(xiàn)病變,1:32,1:64,128和病毒對(duì)照都全部病變,沒有太大差異(見圖4)。病毒拷貝數(shù)定量結(jié)果顯示,復(fù)合緩釋酸1:16稀釋后仍然能夠顯著抑制病毒的復(fù)制,具有較好的抗病毒效果。

        實(shí)驗(yàn)5表明,一定濃度的復(fù)合緩釋酸作用PEDV一段時(shí)間后,可以抑制病毒的復(fù)制。

        綜上所有實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論,一定濃度復(fù)合緩釋酸對(duì)病毒的核酸、蛋白都有破壞作用,可以直接殺滅病毒。同時(shí),一定濃度復(fù)合緩釋酸可以抑制病毒的細(xì)胞中的增殖,影響病毒的復(fù)制。

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