劉 杰，劉守川，趙坤坤，李英英，劉維康

(洛陽(yáng)中科基因檢測(cè)診斷中心有限公司,河南 洛陽(yáng) 471000)

2018年1月河南某豬場(chǎng)發(fā)生一起以關(guān)節(jié)腫脹、肺臟膿腫和胸腔積液為主要特征的疾病，臨床診斷疑似為副豬嗜血桿菌，無(wú)菌取胸腔積液和肺臟送至實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室鑒定，分離到一株革蘭氏陽(yáng)性桿菌，經(jīng)生化、16S rRNA鑒定并結(jié)合臨床癥狀確定為由化膿隱秘桿菌引起的細(xì)菌疾病。

1 材料與方法

1.1 組織

無(wú)菌采取發(fā)病仔豬的肺臟和胸腔積液。

1.2 主要培養(yǎng)基及試劑

哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基；無(wú)支原體新生牛血清；革蘭氏染 色 試 劑；DNA Taq酶、dNTPs、DNAmarker等；細(xì)菌微量生化管及藥敏紙片。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備

按照配方稱取足量哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加相應(yīng)的純化水配制100 mL培養(yǎng)基，121 ℃，滅菌15 min，滅菌結(jié)束后待培養(yǎng)基溫度降至50 ℃左右，加入5 mL的綿羊血，搖勻，倒平皿。

按照配方稱取足量TSA，加相應(yīng)的純化水配制100 mL培養(yǎng)基，121 ℃，滅菌15 min，滅菌結(jié)束后待培養(yǎng)基溫度降至50℃左右，加入5 mL無(wú)支原體新生牛血清和100μL 1%NAD，搖勻，倒平皿。

1.3.2 細(xì)菌分離

無(wú)菌取肺臟病變組織和胸腔積液接于血培養(yǎng)基和TSA+血清+NAD培養(yǎng)基上，37 ℃，厭氧培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)，挑取單個(gè)疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.3.3 生化鑒定

挑取疑似單個(gè)菌落接于微量生化管，進(jìn)行相應(yīng)的生化鑒定。

1.3.4 16SrDNA鑒定

挑取單個(gè)菌落進(jìn)行16SrDNA測(cè)序分析，引物為實(shí)驗(yàn) 室 常 用 引 物 :16S-F1500：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’,16S-R1500：5’-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT，擴(kuò)增出的目的片段大小約為1 500 bp，該引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

PCR采用50μL反應(yīng)體系，即10×PCR Buffer5.0μL、dNTP4.0μL、DNA Taq酶1.0μL，16S-F1500/16S-R1500引物各2.0μL，DNA模板4.0μL，ddH2O 32.0μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 60 s，56℃ 30 s，72℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。取部分PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，剩余產(chǎn)物送北京英濰捷基公司測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.5 藥敏試驗(yàn)

挑取疑似單個(gè)菌落接種于10 mLTSB血清培養(yǎng)基，置于37℃恒溫?fù)u床中，培養(yǎng)5～6 h，取100μL均勻涂布于MH培養(yǎng)基上。用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）[1]，按使用說(shuō)明書將藥敏片均勻放置在其上，37 ℃培養(yǎng)16～18 h后，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小，根據(jù)說(shuō)明書敏感和耐藥性的最小抑菌圈直徑判定菌株的藥敏性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

樣品經(jīng)分離厭氧培養(yǎng)后觀察，血平板和TSA+血清+NAD培養(yǎng)基上為兩種菌落，優(yōu)勢(shì)菌落為一種表面光滑的小菌落，該菌落在血平皿上為β溶血，革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性小桿菌，見(jiàn)圖1。

2.2 生化鑒定結(jié)果

從表1不難看出，分離到的菌株發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖，不發(fā)酵甘露醇、山梨醇，硝酸鹽、接觸酶和吲哚試驗(yàn)陰性，與化膿隱秘桿菌生化特性一致。

2.3 16S rDNA鑒定

圖1 革蘭氏染色鏡檢（1000×）

表1 生化鑒定結(jié)果

利用16S rDNA 檢測(cè)引物擴(kuò)增出大小為1.5 kb左右的目的片段，如圖2。對(duì)測(cè)序結(jié)果用DNASTAR軟件處理，并與MCBI中已發(fā)表的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較，選取同源性最高菌株的16S rRNA基因序列，采用DNASTAR-MEGALIGN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，并系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如圖3。從表2可以看出，目的菌與Trueperella pyogenes strain ATCC 19411同源性為99.7%，證明該菌為化膿隱秘桿菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離到的菌對(duì)頭孢噻呋、桿菌肽、卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、恩諾沙星高度敏感，對(duì)甲氧芐啶、甲砜霉素、鹽酸克林霉素和鹽酸林可霉素耐藥，如表3。

3 討論

圖2 細(xì)菌16S擴(kuò)增結(jié)果

圖3 16S rRNA 基因全序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

化膿隱秘桿菌屬于隱秘桿菌屬，是豬、牛、羊和其他動(dòng)物黏膜上一種條件致病菌[2]，而且對(duì)人類的也有一定的致病性[3]，該菌為原發(fā)性病原體，能夠在家畜間廣泛傳播，導(dǎo)致多種化膿性感染，主要引起化膿性肺炎、關(guān)節(jié)炎而且嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致動(dòng)物因敗血癥死亡[4]。部分癥狀與副豬嗜血桿菌癥狀相似,但其主要引起肝、肺化膿性結(jié)節(jié)，脾出血性腫大，在實(shí)際診斷過(guò)程中需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)一步確定。

化膿隱秘桿菌引起的疾病在牛羊養(yǎng)殖中較為常見(jiàn)，在養(yǎng)豬過(guò)程中較為少見(jiàn)，近年來(lái)有多篇報(bào)道在河北、湖北、湖南等省份發(fā)現(xiàn)由該菌引起的以發(fā)生肝、肺化膿性結(jié)節(jié)為主要特征的病例。

化膿隱秘桿菌主要包括4種毒力因子，即溶血素、膠原結(jié)合蛋白、神經(jīng)氨酸酶及菌毛合成蛋白?；撾[秘桿菌的致病力主要是通過(guò)這4種毒力因子體現(xiàn)，通過(guò)對(duì)這4種毒力因子的研究發(fā)現(xiàn)化膿隱秘桿菌的主要致病機(jī)理是通過(guò)神經(jīng)氨酸酶提高病原菌的黏附力及致病力，并降解抗體，降低宿主免疫防御力從而使宿主發(fā)病，另外溶血素能夠溶解紅細(xì)胞及免疫細(xì)胞，也能夠影響宿主的免疫力。在實(shí)際臨床診斷中通過(guò)對(duì)這4種毒力基因的研究可對(duì)其進(jìn)化過(guò)程進(jìn)行大致推斷[5-7]。

本次藥敏試驗(yàn)敏感藥主要有頭孢噻呋、桿菌肽、卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、恩諾沙星高度敏感。鑒于此次化膿隱秘桿菌主要引起的臨床癥狀主要為關(guān)節(jié)炎和肺臟化膿性結(jié)節(jié)，推薦使用穿透力較強(qiáng)的頭孢噻呋和恩諾沙星，治療效果較為明顯。