黃夢璐， 王 潔， 王 磊

（河南師范大學水產學院，河南新鄉(xiāng)453007）

魚類精子超低溫冷凍保存技術對于魚類種質資源保存、遺傳多樣性保護、新品種選育等均具有重要意義。利用這一技術建立冷凍精子庫，可以解決雌雄發(fā)育不同步和遠距離不同物種間雜交等難題。20世紀50年代，英國學者Blaxter等[1]首次冷凍保存了大西洋鮭的精子，并且獲得了80%的受精率。我國的魚類精子冷凍保存研究開始于20世紀50年代，到目前為止，我國研究人員先后成功保存了江鱈(Lota lota)[2]、刀鱭(Coilia ectenes)[3]、美洲鰣魚(Alosa sapidissima)[4]、小黃魚 (Larimichthys polyactis)[5]、哲羅鮭(Hucho taimen)[6]和雙斑東方鲀(Takifugu bimaculatus)[7]等魚類精子。但是，目前這一技術仍面臨許多問題，一方面，精子冷凍保存的最適稀釋液及濃度、最適抗凍劑及濃度等篩選步驟較繁瑣，缺少自動化篩選儀器；另一方面，魚類精子冷凍保存效果的評價體系有待完善。為解決上述問題，本文分析了超低溫保存魚類精子的相關報道，并進行了歸納總結，以期為后續(xù)的相關研究提供一定的理論指導。

1 稀釋液

稀釋液可以為精子提供適宜的存活環(huán)境、營養(yǎng)，同時還可以降低抗凍劑對精子的毒害作用。近年來，我國學者對鰈形目、鯰形目和鯉形目等魚類進行了精子冷凍保存實驗（表1），其中應用較多的稀釋液有Hank’s 鹽溶液（HBSS）和D-15，其次是魚用任氏液，而Ringer液、MPRS和D-17等應用較少。研究發(fā)現(xiàn)，Hank’s鹽溶液較適用于鱸形目魚類精子的保存，D-15或D-15改良液適用于鯉形目魚類精子的保存。

表1 魚類精子冷凍保存常用的稀釋液、抗凍劑和稀釋比例Tab1 The dilute solution, cryopretectant and dilution rate of fish sprm commonly used in cryopreservation

續(xù)表

2 抗凍劑

抗凍劑可以減少冰晶對精子結構的損傷，延長精子的壽命。目前常用的抗凍劑為滲透性抗凍劑，如二甲基亞砜（DMSO）、甲醇（MeOH）、丙二醇（PG）、乙二醇（EG）、甘油（Gly）等。近年來，我國學者在進行魚類精子超低溫冷凍實驗時對抗凍劑的使用情況如表1所示，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)最常用的抗凍劑為DMSO，濃度約為5%～15%[16,23]；其次是EG，濃度約在為5%～20%[22]，也可按照一定比例合用兩種或兩種以上的抗凍劑。總之，魚類精子冷凍保存時，鰈形目使用DMSO作為抗凍劑較多[20,24,26]；鯰形目使用MeOH作為抗凍劑較多[16]；鯉形目使用DMSO[3,18]和EG[29]較多；鱸形目的魚類沒有特定的抗凍劑選擇偏向，其他魚類因數(shù)據較少，暫不能做出關于相關判斷。此外，在配制保護液時可以加入添加劑，最常見的添加劑有二糖、維生素和蛋黃等。如在保存太平洋鱈(Gadus macrocephalus)[33]精子的保護液中添加了12%的丙二醇和10%的蛋黃。

3 冷凍程序

目前最常用的冷凍方法有程序降溫法、二步法和三步法，也有不經降溫直接冷凍的，冷凍方法一般遵循慢凍速融的原則，關鍵是尋找最佳降溫速率。不同種魚類精子適宜的降溫速率（高度）有所不同，若精子在冷凍過程中胞內外水的進出達到平衡，則獲得的冷凍效果最好。近年來，我國學者在多種魚類中均找到了適宜的降溫方法。其中二步法[8,12,16-18]是被應用最多的冷凍方法，其次是三步法[3,4,7,16,21,25,26]和程序降溫法[5,33]。鰈形目[24,25]、鯡形目[3,4]、鲀科[7]大都用三步法冷凍精子，鯉形目[17]大都用二步法冷凍精子。

4 解凍方法

解凍可分為室溫解凍和水浴解凍，目前常用的方法為水浴解凍。近年來我國學者探索了多種魚類解凍的方法，例如：鲀吻黃蓋鰈精子先從冷凍管中取出，平衡1 min 后迅速投入37 ℃水浴鍋中搖晃解凍[25]；點帶石斑魚精子在液氮蒸汽中平衡10 min 后，直接放入40 ℃水浴至完全融解[21]；刀鱭精子在液氮口平衡5 min后，在37 ℃水浴中解凍[3]；興國紅鯉精子在37 ℃水浴條件下解凍100 s[8]；西伯利亞鱘精子在40 ℃水浴條件下解凍[9]；光唇魚精子[17]和翹嘴鱖精子[16]在37 ℃條件下水浴解凍。

展望

魚類精子超低溫冷凍保存不僅有利于魚類精子庫和種質資源庫的建立，而且可以為魚類的遺傳育種工作提供技術支持。但是目前為止，超低溫冷凍保存魚類精子依然存在許多技術瓶頸：一是由于魚類種類較多，每種魚類精子的最適保存條件各異，這加大了精子凍存的難度，也制約了超低溫冷凍保存技術發(fā)展；二是配子質量評價系統(tǒng)不完善，對精子的質量評估無統(tǒng)一標準。

為了解決以上問題，今后可以從以下幾個方面加大研究：一方面建立操作標準。可首先從每個科中篩選1種具有代表性的魚類建立冷凍保存技術，此科中的其他魚類可以參照該標準進行摸索，從而減少探索新物種精子冷凍保存的時間；另一方面參考人類的精子評估體系建立通用的配子質量評估體系。例如使用CASA (Computer-aided sperm analysis) 系統(tǒng)檢測平均直線速度、平均曲線速度、平路徑速度等。相信隨著不同科中代表性魚類精子超低溫冷凍保存技術和精子檢測技術標準的建立，魚類精子超低溫冷凍保存技術必將取得快速的發(fā)展。