楊 磊，穆 紅，謝莉麗

(天津市第一中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300192)

細(xì)胞的生存與基因組的完整性緊密相關(guān)，應(yīng)用離子射線、氧化劑以及基因組毒性藥物破壞細(xì)胞基因組DNA是殺傷腫瘤細(xì)胞的重要手段。然而，這些外界刺激會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)特異的信號(hào)通路啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)反應(yīng)清除外源刺激物在基因組上造成的損傷，使腫瘤細(xì)胞對(duì)治療方法產(chǎn)生抵抗力[1-2]。微小RNA(MiRNA)是一種長度約20個(gè)核苷酸組成的小片段RNA分子，基于種子序列與靶基因mRNA非編碼區(qū)的特異性結(jié)合，在Ago蛋白復(fù)合物加工元件的作用下，實(shí)現(xiàn)靶基因mRNA的快速降解以及蛋白的翻譯阻滯，降低靶基因在細(xì)胞內(nèi)的水平，進(jìn)而影響細(xì)胞表型[3-4]。近期報(bào)道顯示，microRNA分子通過調(diào)控靶基因的表達(dá)參與了細(xì)胞中基因組DNA的損傷修復(fù)過程。E3泛素化蛋白連接酶(Ndfip1)和蛋白磷酸酶調(diào)控亞基B′α(PPP2R5A)具有修復(fù)DNA、維持DNA穩(wěn)定性的功能，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)miR-388-5p可以干擾上述2種蛋白分子的表達(dá)，進(jìn)而干擾細(xì)胞修復(fù)DNA損傷[5]。在前列腺癌細(xì)胞中，miR-890和miR-744-3p分別通過抑制有絲分裂靜息蛋白缺陷2樣蛋白2(MAD2L2)和Rad23核剪切修復(fù)蛋白同源物B(Rad23B)阻礙離子輻射誘導(dǎo)性DNA損傷修復(fù)過程[6]。MiR-301b基因位點(diǎn)位于人類第22條染色短臂1區(qū)2帶，該基因首先轉(zhuǎn)錄加工成長度為78 bp的發(fā)卡狀前體RNA分子，進(jìn)一步加工后形成成熟體非編碼RNAmiR-301b。MiR-301b在細(xì)胞增殖、侵襲以及凋亡等細(xì)胞生命活動(dòng)中都發(fā)揮著重要作用[7-9]。C末端結(jié)合蛋白作用蛋白(Ctip)基因位點(diǎn)位于人類第18條染色體短臂1區(qū)2帶，其表達(dá)產(chǎn)物是一種內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶，可以特異性識(shí)別和結(jié)合分叉DNA分子的5′端折疊結(jié)構(gòu)，與Mre11雙鏈斷裂修復(fù)核酶、Rad50重組酶和Nbs11煙草花葉病毒抗性N樣蛋白結(jié)合后以同源重組(HR)的形式修復(fù)損傷DNA分子[10-11]。新輔助化療聯(lián)合放射治療是目前治療宮頸癌的常用手段，在治療中，化學(xué)藥物通過誘導(dǎo)DNA損傷、抑制細(xì)胞分裂增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的方式殺傷癌細(xì)胞。但細(xì)胞中存在參與DNA修復(fù)的生物分子，這些分子阻礙了化學(xué)藥物對(duì)細(xì)胞的殺傷作用[12]。因此，揭示宮頸癌細(xì)胞中DNA修復(fù)機(jī)制，可以為探索干擾DNA損傷修復(fù)的方法奠定基礎(chǔ)，最終為克服宮頸癌細(xì)胞耐藥性及疾病治療提供幫助。在本項(xiàng)研究中，筆者探討了miR-301b與Ctip基因表達(dá)的作用關(guān)系及其機(jī)制、以及這種作用關(guān)系對(duì)基因組DNA損傷修復(fù)過程的影響，并以此為基礎(chǔ)提出了宮頸癌細(xì)胞修復(fù)DNA損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 宮頸癌細(xì)胞株Siha購自于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 EnSpire Mutilabel Reader酶標(biāo)儀，芬蘭PerkinElmer公司；Alpha Innotech FluroChem FC2凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Alpha Innotech公司；LightCycle96 熒光定量PCR儀，瑞士Roche 公司；BD Accuri C6 Plus流式細(xì)胞儀，美國BD Sciences公司。

1.2.2試劑 miR-301b模擬物、miR-301b抑制物以及陰性對(duì)照核酸N.C.和抑制物N.C.由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成；質(zhì)粒構(gòu)建、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中用到逆轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增引物均由北京天潤奧科生物科技有限公司合成；RNA/DNA X-fect轉(zhuǎn)染試劑、PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶以及SYBR Premix Ex Taq Ⅱ熒光定量PCR試劑盒購自日本 Takara生物技術(shù)有限公司；兔抗人Ctip、 GADPH抗體以及HRP標(biāo)記羊抗兔IgG Fc抗體購自美國Proteintech公司；鼠抗人γ-H2AX蛋白抗體及Alexa Fluor?488 dye 標(biāo)記兔抗鼠抗體購自美國 Abcam有限公司；mirVana RNA提取試劑盒來源于美國Ambion公司；Annexin-V 凋亡檢測試劑盒來源于美國BD Sciences公司。

1.3方法

1.3.1質(zhì)粒構(gòu)建 本項(xiàng)目構(gòu)建的質(zhì)粒包括靶基因過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/Ctip；熒光報(bào)告質(zhì)粒pcDNA3.1/EGFP-Ctip-wtUTR和pcDNA3.1/EGFP-Ctip-mutUTR。質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃，1 h，70℃，15 min；PCR擴(kuò)增條件：94 ℃，2 min； 94 ℃，30 s、57 ℃，30 s、72 ℃，3 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min；UTR核酸模擬物退火條件：100 ℃，5 min，水浴緩慢降至37 ℃。寡核苷酸引物序列請(qǐng)見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)中用到的寡核苷酸片段

注：5′,3′分別代表核酸片段的5′和3′末端

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的1640細(xì)胞培養(yǎng)液，于37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將細(xì)胞以約5×104個(gè)/毫升的密度種于培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，用RNA/DNA X-fectTM轉(zhuǎn)染試劑將寡核苷酸miR-301b模擬物、miR-301b抑制物、N.C.、抑制物N.C.、以及質(zhì)粒pcDNA3.1/Ctip、pcDNA3.1/EGFP-Ctip-wtUTR和pcDNA3.1/EGFP-Ctip-mutUTR轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。

1.3.3細(xì)胞藥物刺激 將TNF-α粉末溶解于磷酸緩沖液(PBS)中制備成200 μg/mL的藥物原液，置于-80 ℃條件下儲(chǔ)存。用時(shí)取一定體積的藥物原液加入至細(xì)胞培養(yǎng)液，稀釋成100 ng/mL的工作液刺激細(xì)胞1.5、3和6 h。

1.3.4實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)反應(yīng) 對(duì)目標(biāo)基因miR-301b、Ctip mRNA以及內(nèi)參基因U6小RNA、β-actin mRNA的進(jìn)行熒光半定量，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)后進(jìn)行熔解曲線分析并應(yīng)用2-ΔΔCt方法，按公式：Folds=2-ΔΔCt,ΔΔCt=(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)，其中Ct1為處理樣品中待測基因(miR-301b和Ctip)的臨界循環(huán)數(shù)，Ct2為處理樣品中待測基因?qū)?yīng)的內(nèi)參基因(U6和β-actin)的臨界循環(huán)數(shù)，Ct3為對(duì)照樣品中待測基因的臨界循環(huán)數(shù)，Ct4為對(duì)照樣品中待測基因?qū)?yīng)的內(nèi)參基因的臨界循環(huán)數(shù)，計(jì)算出每組細(xì)胞中目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平。寡核苷酸引物序列請(qǐng)見表2。

1.3.5Western-blot蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 對(duì)目的Ctip蛋白及其內(nèi)參蛋白GADPH進(jìn)行電泳分離、抗體標(biāo)記及化學(xué)顯影步驟。實(shí)驗(yàn)條件：上樣量，25 μg每孔；轉(zhuǎn)膜電流及時(shí)間，260 mA、2 h；抗體加入量，1∶500(1抗)、1∶2 000(2抗)；抗體孵育時(shí)間，1 h(1抗)、2 h(2抗)。影像捕捉后，根據(jù)目的樣本灰度值(目的蛋白條帶亮度-背景值)與對(duì)應(yīng)內(nèi)參蛋白灰度值(內(nèi)參看白GADPH條帶亮度-背景值)的比值，得到目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6γ-H2AX免疫熒光實(shí)驗(yàn) 滅活固定細(xì)胞后，用磷酸化H2AX蛋白抗體標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的靶蛋白、流式細(xì)胞術(shù)檢測靶蛋白熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)條件：1%甲醛細(xì)胞滅活15 min；70%乙醇細(xì)胞固定3 h；抗體加入量，1∶100(1抗)、1∶100(2抗)；抗體孵育時(shí)間，2 h(1抗)、30 min(2抗)；流式細(xì)胞采集量，10 000個(gè)。在研究中，依據(jù)藥物處理?xiàng)l件、轉(zhuǎn)染寡核酸、質(zhì)粒種類不同，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組都對(duì)應(yīng)著各自對(duì)照組。對(duì)應(yīng)關(guān)系如下：磷酸鹽緩沖液對(duì)照組與TNF-α處理實(shí)驗(yàn)組；N.C.轉(zhuǎn)染對(duì)照組與miR-301b模擬物轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組；抑制物N.C.轉(zhuǎn)染對(duì)照組與抑制物轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組；pcDNA3.1與miR-301b模擬物共轉(zhuǎn)染對(duì)照組與pcDNA3.1/Ctip與miR-301b模擬物共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)抗體標(biāo)記后，可以直接在流式細(xì)胞術(shù)平臺(tái)上進(jìn)行檢測，上樣檢測后，各組細(xì)胞群的γ-H2AX蛋白的平均熒光強(qiáng)度會(huì)顯示在平臺(tái)上，每組細(xì)胞各做3個(gè)平行樣。

1.3.7彗星實(shí)驗(yàn) 將400 mL含有8 000個(gè)細(xì)胞的磷酸鹽緩沖液與1.2 mL 1%的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠混合，平鋪在載玻片上。膠凝固后，將載玻片置于裂解液(2%肌氨酰，0.5 mol/L乙二胺四乙酸二鈉，0.5 mg/mL蛋白酶K)中37 ℃孵育過夜。用電泳液(90 mmol/L三羥基氨基甲烷，90 mmol/L硼酸，2 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉)浸洗載玻片3次，每次20 min。浸洗后，在電壓為14 V的條件下，電泳25 min。用濃度為2.5 μg/mL的溴化乙錠水溶液浸泡載玻片20 min。染色后，用400 mL去離子水浸洗載玻片20 min。然后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照。利用彗星實(shí)驗(yàn)成像工程軟件(CASP)計(jì)算DNA尾距，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組計(jì)算50個(gè)DNA尾距。

表2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用到的引物序列

注：5′、3′分別代表核酸片段的5′和3′末端

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1宮頸癌Siha細(xì)胞修復(fù)基因組DNA損傷的分析 用TNF-α試劑(處理組)和等體積的磷酸鹽緩沖液(對(duì)照組)作用Siha細(xì)胞后，測定各組細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX表達(dá)的平均水平以及DNA彗星狀平均尾距，監(jiān)測胞內(nèi)DNA損傷程度。與對(duì)照組細(xì)胞相比，TNF-α處理組細(xì)胞經(jīng)藥物刺激1.5和3 h后，胞內(nèi)γ-H2AX蛋白平均表達(dá)水平分別上升了0.26和0.48倍，同時(shí)平均尾距增加了0.58和0.96倍(P<0.05)，而藥物刺激細(xì)胞6 h后，TNF-α處理組細(xì)胞中的γ-H2AX蛋白平均表達(dá)水平以及平均尾距與對(duì)照組相比無明顯差異(圖1A和B)。

2.2miR-301b模擬物、miR-301b抑制物對(duì)宮頸癌細(xì)胞中Ctip基因表達(dá)的影響 應(yīng)用PCR實(shí)驗(yàn)分別檢測TNF-α處理組和對(duì)照組細(xì)胞中miR-301b、Ctip mRNA相對(duì)表達(dá)水平。在藥物刺激1.5和3 h后，與對(duì)照組相比，TNF-α處理組細(xì)胞中miR-301b表達(dá)水平分別下降了25.33%和38.63%(P<0.05)(圖2)，同時(shí)Ctip mRNA的水平分別上升了0.19和0.37倍(P<0.05)(圖3)。分別轉(zhuǎn)染miR-301b模擬物(miR-301b模擬物組)、miR-301b陰性對(duì)照核酸N.C.(N.C.組)、miR-301b抑制物 (抑制物組)以及抑制物對(duì)照核酸抑制物N.C.(抑制物N.C.組)至細(xì)胞，應(yīng)用PCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞中Ctip mRNA和蛋白表達(dá)水平。與N.C.組細(xì)胞相比，miR-301b組細(xì)胞中Ctip mRNA和蛋白表達(dá)水平分別下降44.60%和30.53%(P<0.05)；與抑制物N.C.組細(xì)胞相比，抑制物組細(xì)胞中Ctip mRNA和蛋白水平分別上升0.34和0.27倍(P<0.05)(圖4)。TargetScanHuman、miRBD、DIANA TOOL以及Pictar 4種生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果顯示，Ctip mRNA上3208至3214核苷酸位點(diǎn)的核酸序列與miR-301b的2到8核苷酸位點(diǎn)的種子序列反向互補(bǔ)，是miR-301b潛在的靶定位點(diǎn)(圖5)；熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與N.C.組細(xì)胞相比，嵌合有野生型Ctip mRNA3′UTR的報(bào)告載體(pcDNA3.1/EGFP-Ctip -wtUTR)上的綠色熒光蛋白報(bào)告基因在miR-301b模擬物組細(xì)胞中的表達(dá)水平下降19.53%(P<0.05)；與抑制物N.C.組細(xì)胞相比，報(bào)告基因在抑制物組細(xì)胞中的表達(dá)水平上升0.15倍(P<0.05)；然而嵌有突變型3′UTR載體(pcDNA3.1/EGFP-Ctip-mutUTR)上的報(bào)告基因表達(dá)水平在上述各組細(xì)胞中的表達(dá)水平無明顯差異(圖6)。

注：A為TNF-α刺激對(duì)γ-H2AX蛋白水平的影響；B為TNF-α刺激對(duì)DNA彗星狀尾距的影響

圖1TNF-α刺激對(duì)γ-H2AX蛋白水平和DNA彗星狀尾距的影響

圖2 TNF-α刺激對(duì)miR-301b表達(dá)水平的影響

圖3 TNF-α刺激對(duì)Ctip mRNA表達(dá)水平的影響

2.3miR-301b對(duì)宮頸癌細(xì)胞修復(fù)DNA損傷的影響 分別向細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-301b模擬物、miR-301b抑制物以及它們各自的陰性對(duì)照核酸N.C和抑制物N.C.后，測定各組細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX蛋白平均表達(dá)水平和DNA彗星狀平均尾距。TNF-α刺激細(xì)胞6 h后，與N.C.組細(xì)胞相比，miR-301b模擬物組細(xì)胞中γ-H2AX平均表達(dá)水平和平均尾距分別上升0.78倍和0.42倍(P<0.05)；刺激細(xì)胞3 h后，與抑制物N.C.組細(xì)胞相比，抑制物組細(xì)胞中γ-H2AX蛋白平均表達(dá)水平和平均尾距分別下降22.13%和26.09%(P<0.05)(圖7A和B)。

圖4 轉(zhuǎn)染miR-301b模擬物、抑制物對(duì)Ctip

圖5 miR-301b與Ctip mRNA 3′UTR及其突變體

圖6 miR-301b與Ctip mRNA 3′UTR及其突變體

注：A為轉(zhuǎn)染miR-301b模擬物、抑制物對(duì)γ-H2AX蛋白表達(dá)水平的影響;B為轉(zhuǎn)染miR-301b模擬物、抑制物對(duì)DNA彗星狀尾距的影響

圖7轉(zhuǎn)染miR-301b模擬物、抑制物對(duì)γ-H2AX蛋白表達(dá)水平和DNA彗星狀尾距的影響

2.4Ctip基因表達(dá)對(duì)miR-301b干擾宮頸癌細(xì)胞修復(fù)DNA損傷的影響 分別將pcDNA3.1/Ctip或其對(duì)照載體pcDNA3.1與miR-301b模擬物共轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞，測定各組細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX蛋白平均表達(dá)水平和DNA彗星狀平均尾距。TNF-α刺激細(xì)胞1.5和3 h后，與共轉(zhuǎn)染miR-301b模擬物和pcDNA3.1的細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染miR-301b模擬物和pcDNA3.1/Ctip質(zhì)粒的細(xì)胞中γ-H2AX蛋白平均表達(dá)水平分別下降39.02%和44.35%，與此同時(shí)，平均尾距分別下降33.60%和38.12%(P<0.05)(圖8A和B)。

注：A為過表達(dá)Ctip基因?qū)iR-301b模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中γ-H2AX蛋白表達(dá)水平的影響;B為過表達(dá)Ctip基因?qū)iR-301b模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中彗星狀DNA尾距的影響

圖8過表達(dá)Ctip基因?qū)iR-301b模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中γ-H2AX蛋白表達(dá)水平和彗星狀DNA尾距的影響

3 討 論

TNF-α是一種相對(duì)分子質(zhì)量為26×103的跨膜蛋白，經(jīng)金屬轉(zhuǎn)換酶的作用后，可由跨膜型蛋白轉(zhuǎn)換為可溶性型細(xì)胞因子，在不同的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[13]。TNF-α處理細(xì)胞后，會(huì)使細(xì)胞線粒體內(nèi)產(chǎn)生大量胞內(nèi)活性氧中間分子(ROI)，這些分子經(jīng)金屬離子催化后能形成具有強(qiáng)氧化活性的羥基自由基，產(chǎn)生的這些自由基可以通過氧化反應(yīng)氧化DNA分子中核苷酸，造成DNA損傷[14-15]。文獻(xiàn)記錄顯示，用濃度為1、10和100 ng/mL的TNF-α試劑處理淋巴細(xì)胞1 h后，細(xì)胞內(nèi)DNA損傷標(biāo)志物的水平即可出現(xiàn)顯著升高，而藥物處理4 h后，損傷標(biāo)志物水平出現(xiàn)下降。在藥物處理24 h后，濃度為1、10 ng/mL TNF-α試劑造成標(biāo)志物水平升高的現(xiàn)象消失，100 ng/mL TNF-α試劑造成標(biāo)志物水平升高的現(xiàn)象仍存在。這些文獻(xiàn)中報(bào)道的數(shù)據(jù)說明2個(gè)問題：(1)TNF-α處理細(xì)胞后能夠誘發(fā)DNA損傷修復(fù)反應(yīng)；(2)100 ng/mL TNF-α試劑對(duì)細(xì)胞DNA損傷作用更持久[16]。目前還沒有利用TNF-α試劑誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)反應(yīng)的文獻(xiàn)記錄，因此，本研究依據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，將TNF-α試劑濃度設(shè)定為100 ng/mL，分別在藥物處理后，1.5、3 h 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察DNA損傷標(biāo)志物的水平確定TNF-α能否造成宮頸癌細(xì)胞中DNA的損傷，6、24 h 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察損傷標(biāo)志物的水平確定TNF-α誘導(dǎo)性DNA損傷可否被宮頸癌細(xì)胞修復(fù)。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，用TNF-α刺激Siha細(xì)胞1.5和3 h后，細(xì)胞中的DNA損傷標(biāo)記物γ-H2AX蛋白的平均表達(dá)水平以及DNA彗星狀平均尾距均出現(xiàn)明顯升高，然而當(dāng)TNF-α刺激時(shí)間延長至6 h，γ-H2AX蛋白平均表達(dá)水平及DNA平均尾距卻未出現(xiàn)顯著差異。這說明TNF-α可以造成Siha細(xì)胞內(nèi)基因組DNA的損傷，但該損傷在6 h內(nèi)就可以被細(xì)胞完全修復(fù)。TNF-α刺激造成了miR-301b的上升和Ctip mRNA水平的下降。為探索miR-301b和Ctip mRNA表達(dá)水平變化之間有無關(guān)聯(lián)，筆者利用轉(zhuǎn)染技術(shù)，對(duì)TNF-α處理細(xì)胞進(jìn)行了信號(hào)通路干預(yù)。與相應(yīng)對(duì)照核酸相比，轉(zhuǎn)染miR-301b模擬物會(huì)導(dǎo)致Ctip mRNA和蛋白水平的降低，而轉(zhuǎn)染miR-301b抑制物會(huì)使Ctip mRNA和蛋白水平升高。該結(jié)果說明，miR-301b可能影響Ctip基因表達(dá)。生物信息學(xué)分析預(yù)測出了Ctip mRNA 3′UTR上miR-301b的靶定位點(diǎn)。與相應(yīng)對(duì)照組細(xì)胞相比，pcDNA3.1/EGFP-Ctip-wtUTR載體上報(bào)告基因的表達(dá)強(qiáng)度在miR-301b模擬物組細(xì)胞中顯著降低、在抑制物組細(xì)胞中明顯升高；而pcDNA3.1/EGFP-Ctip-mutUTR載體上報(bào)告基因表達(dá)強(qiáng)度在上述兩組細(xì)胞中無顯著變化。 這些說明，miR-301b是通過直接結(jié)合Ctip mRNA 3′UTR上預(yù)測出的靶定位點(diǎn)來抑制Ctip基因表達(dá)的。TNF-α作用后，細(xì)胞內(nèi)miR-301b、Ctip mRNA表達(dá)水平的變化說明這兩種分子可能參與了基因組DNA的損傷修復(fù)過程。此外，該基因產(chǎn)物還可以通過微同源介導(dǎo)末端連接的方式(MMEJ)完成損傷DNA分子的修復(fù)[17]。因此，miR-301b對(duì)Ctip基因表達(dá)的調(diào)控可能會(huì)影響細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)過程。與相應(yīng)對(duì)照組細(xì)胞相比，miR-301b模擬物組細(xì)胞中γ-H2AX蛋白平均表達(dá)水平以及DNA彗星狀平均尾距的上升以及抑制物組細(xì)胞中γ-H2AX蛋白平均表達(dá)水平和平均尾距的下降說明miR-301b會(huì)干擾DNA的損傷修復(fù)。而與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1的細(xì)胞相比， pcDNA3.1/Ctip質(zhì)粒與miR-301b模擬物共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX蛋白平均表達(dá)水平下降則說明miR-301b可通過抑制Ctip基因表達(dá)干擾DNA的損傷修復(fù)。

4 結(jié) 論

宮頸癌Siha細(xì)胞通過下調(diào)miR-301b增強(qiáng)Ctip基因表達(dá)促進(jìn)基因組DNA的損傷修復(fù)。