陳曉璐,張淑輝,王文茹,于雯,羅靜靜,彭福田

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超表達不同亞基對番茄葉綠素熒光參數及光合特性的影響

陳曉璐,張淑輝,王文茹,于雯,羅靜靜,彭福田*

山東農業(yè)大學 園藝科學與工程學院, 山東 泰安 271018

以超表達番茄株系（T41、T43、T44）、PpSnRK1β株系（T21、T23）、PpSnRK1β株系（T91、T92）及野生型番茄（）為試材，研究SnRK1對番茄葉綠素熒光參數及光合特性的影響。結果表明，植物的潛在最大光能轉換效率（）比野生型高5.13%-7.70%；PSII的實際光化學量子效率（ΦPSII）比野生型高44.44%~94.44%。同時與野生型番茄相比，超表達各亞基的番茄功能葉片的凈光合速率均有不同程度的提高，其中PpSnRK1β超表達株系比野生型WT提高38.76％和42.18%；CO2飽和點比野生型番茄均有不同程度的提高，比野生型高3.6%~30.73%。各轉基因株系的胞間CO2濃度和氣孔導度均高于野生型，并且隨著中午氣溫的升高，野生型番茄胞間CO2濃度明顯下降，而轉基因株系沒有顯著的下降。因此，說明SnRK1對植物光合作用有重要的調控作用。

SnRK1; 番茄; 葉綠素熒光參數; 光合作用

（蔗糖非發(fā)酵–1–型相關蛋白激酶–1）與酵母中和哺乳動物中蔗糖非發(fā)酵相關的蛋白激酶在序列上高度保守[1]，在結構上，由一個催化亞基和與兩個調節(jié)亞基組成三元復合體[2]，是植物體內生理活動的調控樞紐之一，在植物的礦物質攝取、非生物脅迫、逆境信號轉導和生理代謝、ABA信號轉導以及植物生長發(fā)育等各種激素代謝過程中發(fā)揮廣泛的作用[3]，主要通過磷酸化修飾代謝酶活性的方式參與其中[4,5]。

光合作用是番茄生長發(fā)育和產量形成的基礎，而番茄光合作用除受植株本身內在因素的制約外，還與CO2等各種環(huán)境因素密切相關[6]。CO2是空氣中常見的化合物，也是植物進行光合作用的底物，目前空氣中的CO2濃度(330 μmol·mol-1左右)遠遠低于植物的CO2飽和點，較低的CO2濃度就成為植物光合速率主要限制因子。近幾年，大氣中CO2濃度逐漸升高，CO2濃度升高會影響植物的生理反應，進而影響植物地上與地下部分的質量和生物量分配，以及土壤中根系和土壤生物的活動[7]。植物體內也相應地做調節(jié)，來應對這一外界環(huán)境的變化，例如，大氣中CO2濃度升高在增強植物碳水化合物積累的同時，也需要植物形成一個更加強壯的根系以便吸收更多的養(yǎng)分，維持植物的正常生長，其中促進側根的生長和發(fā)育是非常重要的方面。另外，大氣CO2濃度升高在促進植物生長發(fā)育的同時，也會對植物的氣孔密度、導度和運動帶來明顯的影響。之前關于對蛋白激酶相應機制的研究主要集中于碳氮代謝方面，這一方面的研究也越來越引起人們重視。

葉綠素被視為光合作用系統(tǒng)的內在探針，葉綠素熒光動力學過程研究是目前最為先進的無損傷測定植物光合作用能量吸收、傳遞、耗散、分配的的重要研究內容和方法。與“表觀性”的氣體交換指標相比，葉綠素熒光參數更具有反映“內在性”特點[8]。郭培國等[9]研究發(fā)現，增加銨態(tài)氮施用比例，煙草的和值升高，、Fv/F、比值有所上升，有利于改善光合特性，提高產量，改善品質。張其德等[10]對不同產量水平的水稻品種進行了苗期熒光動力學測定，結果表明，不同水稻品種苗期葉片的Fv/F和，均與該品種的產量水平呈正相關，其符合率高達93%。這說明幾乎所有的光合作用過程的變化均可通過葉綠素熒光反映出來，是一種簡便、可靠、快捷的方法。

通過本實驗室前期對果樹蛋白激酶的研究，發(fā)現平邑甜茬蛋白激酶亞基編碼基因在番茄中超表達提高了植株的光合速率、淀粉含量及其利用率[11,12]，通過對數字基因表達譜的分析顯示，光合途徑中差異表達的10個基因中7個基因的轉錄水平被上調[13]。這些結果都表明，參與對植物光合途徑的調控，但其機理尚不清楚。為進一步探究果樹蛋白激酶的功能，本研究以超表達各亞基的番茄為試驗材料，探討1和2對番茄酶活性、葉綠素熒光參數、凈光合速率、CO2飽和點等光合活性的影響，研究桃蛋白激酶各亞基對葉綠素熒光參數及光合特性的調節(jié)作用，為進一步闡明果樹蛋白激酶的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以野生型‘Sy12f’番茄（）和超表達1和2番茄植株為試材。

1.2 SnRK1酶活性測定

酶活性檢測參照王貴芳等[13]的測定方法。

1.3 葉綠素熒光參數測定

使用FMS2葉綠素熒光儀（英國hansatech公司）于上午10點到12點測定在自然光下穩(wěn)態(tài)熒光（F）、最大熒光值（F）和最大可變熒光（F），并于遮光暗處理20 min后測定暗適應的最小熒光（F）、最大熒光（F）和最大可變熒光（F）；由此得出暗適應和光適應下PSII最大光化學效率（和）、PSII的實際光化學量子效率（ΦPSII）和光化學淬滅系數（qP）。

1.4 凈光合速率、CO2飽和點等光合活性指標測定

在8月份晴天選擇充分展開的基部以上第四葉，采用CIRAS-3便攜式光合儀（PP Systems，美國），CO2濃度設定為390 μL?L-1，同時測定其凈光合速率、胞間CO2濃度和氣孔導度。測定不同番茄株系CO2飽和點時，CO2濃度由光合儀配套的CO2小鋼瓶進行調節(jié)，測定時設定的內源光強為1100 μmol?m-2?s-1，每個CO2濃度下控制測定時間為300 s，數據穩(wěn)定后記錄，5次重復取平均值。

2 結果與分析

2.1 番茄株系SnRK1酶活

對超表達株系T41、T43、T44，1超表達株系T21、T23和2超表達株系T91、T92進行酶活性檢測，結果顯示其酶活性與對照野生型番茄WT相比都有所提高，分別增加6.82%、14.74%、18.31%，2.95%、9.54%和53.33%、36.47%（圖1）。

圖 1 野生型及轉基因番茄株系葉片中SnRK1酶活性

注：WT：野生型；T41、T43和T44：超表達番茄株系；T21和T23：超表達1番茄株系；T91和T92：超表達2番茄株系。

Note: WT: wild type tomato; T41, T43 and T44: transgenictomato lines; T21 and T23: transgenic1tomato lines; T91 and T92: transgenic2tomato lines.

2.2 番茄株系葉綠素熒光參數

通過對野生型及各轉基因株系進行葉片葉綠素熒光參數的測定，結果顯示，與對照野生型番茄WT相比，除T41外，其他轉基因番茄株系的F均高于野生型，其中T23和T91分別比野生型高10.79%和9.12%，差異顯著。由表可以看出，轉基因番茄株系葉片的和比野生型均有不同程度的提高，其中常用來表示光系統(tǒng)Ⅱ（PSII）的活性，結果顯示，除1超表達株系T21、T23外，超表達株系T41、T43、T44和2超表達株系T91、T92較野生型相比均有明顯提高，分別提高7.70 %、5.13 %、5.13%和7.70%、7.70%（表1）。

PSII的實際光化學量子效率（ΦPSII）反映了在照光條件下PSII反應中心部分關閉下的實際光化學的效率；可變熒光的光化學淬滅系數（qP）可以反映光合活性的高低。由表可以看出，轉基因番茄株系葉片測定的ΦPSII均顯著高于野生型，超表達株系T41、T43、T44，1超表達株系T21、T23和2超表達株系T91、T92分別比野生型高50.00%、61.11%、50.00%，44.44%、50.00%和94.44%、77.78％，其中PpSnRK1β超表達株系T91、T92最為顯著；轉基因番茄株系葉片測定的qP均高于野生型，其中PpSnRK1β超表達株系T92最為顯著（表1）。

表 1 野生型及轉基因番茄株系葉片葉綠素熒光參數

注：同列數字后不同字母表示不同轉基因株系差異達5%顯著水平。

Note: Values followed by different transgenic lines within a column are significant at the 5% level.

2.3 番茄株系凈光合速率

通過對野生型及各轉基因番茄株系進行凈光合速率的測定，結果顯示，超表達株系T41、T43、T44，1超表達株系T21、T23和2超表達株系T91、T92對比野生型番茄WT均有不同程度的提高，其中PpSnRK1β超表達株系最高，分別為20.4 μmol?m-2?s-1和20.9 μmol?m-2?s-1，比野生型WT提高38.76%和42.18%，差異顯著（圖2）。

圖 2 野生型及轉基因番茄株系葉片凈光合速率

2.4 番茄株系二氧化碳飽和點

對野生型及各轉基因株系進行CO2飽和點測定，結果顯示，超表達株系T41、T43、T44，1超表達株系T21、T23和2超表達株系T91、T92對比野生型番茄WT均有不同程度的提高，其中2超表達株系最高，分別高出23.96%和30.73%，差異顯著(圖3)。

圖 3 野生型及轉基因番茄植株CO2飽和點

2.5 番茄株系胞間CO2濃度和氣孔導度日變化

對野生型及各轉基因番茄株系進行胞間CO2濃度及氣孔導度日變化的測定，結果顯示，各轉基因株系的胞間CO2濃度均高于野生型，并且隨著中午氣溫的升高，野生型番茄胞間CO2濃度明顯下降，而轉基因株系沒有顯著的下降（圖4-A）；各轉基因株系的氣孔導度均高于野生型，在11:00時，氣孔導度差異最為顯著，超表達株系、1超表達株系和2超表達株系分別比野生型高12.33%、27.40%和31.51%（圖4-B）。

圖 4 野生型及轉基因番茄株系胞間CO2濃度和氣孔導度的變化

A：野生型及轉基因番茄胞間CO2濃度的變化 Change of intercellular CO2 concentration in wild type and transgenic tomato leaves；B：野生型及轉基因番茄株系氣孔導度的變化 Change of stomatal conductance in wild type and transgenic tomato leaves

3 討論與結論

葉綠素熒光動力學參數主要表達的是植物光合作用中的能量傳遞和轉化[14]，幾乎所有的光合作用過程的變化均可通過葉綠素熒光反映出來，而且其不僅能反映光合作用過程中的光能吸收、激發(fā)能傳遞和光化學反應等的光合作用原初反應過程，而且與其電子傳遞、質子梯度的建立及ATP合成和CO2固定等過程有關。Martin等[15]研究發(fā)現，高溫破壞了PSII，使大麥PSII的電子供體和電子受體失活，光合放氧復合體的功能下降，大麥光合速率降低。前人另外研究發(fā)現，病害脅迫使得PSII開放的反應中心比例和參與CO2固定的電子減少，使光合電子傳遞能力減弱，光合色素捕獲的光能以轉化為化學能的速度和效率變慢，葉片暗反應受阻，PSII量子產量減小，光合速率下降，不利于棉花最終產量的形成[16]，這些都說明PSII反應中心是植物光合作用的重要部位。暗適應初始熒光（F），在一定程度上可以表示植物光合系統(tǒng)中PSII的抗損傷能力。本研究中，通過對葉綠素熒光動力學一系列參數進行測定，結果表明，除T41外，其他各轉基因番茄株系F均高于野生型，一定程度上可以說明轉基因番茄株系的光合系統(tǒng)中PSII的抗損傷能力有所提高。PSII有效光量子產量（）反映了開放PSII反應中心原初光能捕獲能力[17]，而PSII實際光能量子產量（ΦPSII）則是反映反應中心在一部分關閉情況下的實際原初光能捕獲系數[18]，光化學淬滅系數（qP）反映了PSII原初電子受體的開放程度，本研究結果表明，轉各亞基番茄株系、ΦPSII和qP均高于野生型，其中超表達2番茄植株結果最為顯著（表1）。這些結果都說明可以通過改善葉綠素熒光參數調控PSII反應中心進而調節(jié)植物的光合途徑。

光合作用是番茄生長發(fā)育和產量形成的基礎，擬南芥蛋白激酶的α催化亞基編碼基因在葉肉細胞原生體中的瞬時表達發(fā)現，影響到超過1000個基因的表達，其中參與光合作用的基因表達被上調[19]，超表達馬鈴薯的凈光合速率、蒸騰速率、胞間二氧化碳濃度和氣孔導度均明顯高于野生型馬鈴薯[20]，在本研究中發(fā)現轉基因番茄植株功能葉凈光合速率比野生型番茄均有不同程度的提高（圖2），與前人研究相符，這說明可以參與植物光合途徑的調控。到2100年，大氣中CO2濃度將上升至540~970 μmol·mol-1之間[21]。CO2是植物光合作用的反應底物，因此，大氣中CO2濃度升高造成溫室效應的同時，也會影響植物的光合作用，同樣會影響植物的生長。本研究對野生型及超表達番茄植株的CO2飽和點的測定表明，超表達各亞基番茄株系CO2飽和點均高于野生型，其中2在番茄中超表達提高最顯著（圖3），與前人研究相符。氣孔是植物葉片與外界進行氣體交換的主要通道。通過氣孔擴散的氣體有O2、CO2和水蒸汽。植物在光下進行光合作用，經由氣孔吸收CO2。本研究對野生型及超表達番茄植株氣孔導度及胞間CO2濃度的測定表明，與野生型番茄株系相比，轉各番茄株系胞間CO2濃度和氣孔導度受日氣溫影響變化幅度比野生型明顯變小。Ryutaro Morita等[22]在水稻中研究發(fā)現，存在一個水稻營養(yǎng)器官淀粉合成過程中的正調控因子CRCT，超表達水稻的CO2飽和點提高，通過數字基因表達譜分析番茄中也存在CRCT同源基因可以被上調，初步推測可能通過調控此基因來調節(jié)CO2飽和點，但具體機理還需進一步研究。這都說明可能通過參與CO2吸收過程進而調節(jié)光合作用淀粉合成。

綜上所述，在番茄中超表達提高了植株蛋白激酶的活性，改善了葉片中葉綠素熒光參數，提高了葉片的凈光合速率和CO2飽和點，同時增加了植株的胞間CO2濃度和氣孔導度；因此，可能通過改善葉綠素熒光參數及提高CO2吸收量等途徑，調控植物光合作用途徑。但是植物的光合作用是個復雜的過程，蛋白激酶參與光合作用的作用位點及其作用機理，還有待進一步研究發(fā)現。

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Effects of Different Subunits ofOverexpression on Chlorophy II Fluorescence Parameters and Photosynthetic Characteristics of Tomato

CHEN Xiao-lu, ZHANG Shu-hui, WANG Wen-ru, YU Wen, LUO Jing-jing, PENG Fu-tian*

271018,

Effects of SnRK1 on chlorophyll fluorescence parameters and photosynthetic characteristics of tomato were studied by overexpressing PpSnRK1 tomato lines (T41, T43, T44), PpSnRK1 1 lines (T21, T23), PpSnRK1 2 lines (T91, T92) and wild type tomato ().Results showed that the potential maximum light energy conversion efficiency (Fv/Fm) of plants is 5.13%-7.70% higher than that of wild type. PSII actual photochemical quantum efficiency (Φ PSII) is 44.44%-94.44% higher than that of wild type. The net photosynthetic rate of the functional leaves of tomato overexpression of PpSnRK1 subunits increased to some extent, the overexpression lines ofPpSnRK1βwere 38.76% and 42.18% higher than the wild-type WT. The CO2 saturation point of tomato was increased by 3.6% to 30.73% higher than that of wild-type tomato. The intercellular CO2concentration and stomatal conductance of all transgenic lines were all higher than those of wild type. With the increase of noon temperature, the concentration of intercellular CO2of wild type tomato decreased significantly, while that of transgenic lines did not decrease significantly, this indicated that SnRK1 plays an important role in regulating plant photosynthesis.

SnRK1; tomato; chlorophyll fluorescence parameters; photosynthesis

S641.2

A

1000-2324(2019)03-0361-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.03.002

2018-02-27

2018-04-02

國家自然科學基金(31672099);山東省“雙一流”建設獎補資金(SYL2017YSTD10);國家現代農業(yè)技術體系建設專項資金(CARS-31)

陳曉璐(1992-),女,碩士研究生,主要從事果樹生理生態(tài)研究. E-mail:chenxiaolu1992@163.com

Author for correspondence. E-mail:pft@sdau.edu.cn