曾海清，熊君暉，溫順華，林海軍，孫旭東

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)?fù)興醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 100038;2.廈門萬泰凱瑞生物技術(shù)有限公司研發(fā)部，福建廈門 361022)

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染引起的嚴(yán)重危害人類健康的慢性呼吸道傳染病，是我國(guó)重點(diǎn)控制的重大疾病之一，也是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題和社會(huì)問題[1-5]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道，目前全球有近1/3的人感染了MTB，其中我國(guó)MTB感染率高達(dá)44.5%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于世界平均感染水平[6]。人被MTB感染后，大部分會(huì)成為無癥狀的潛伏性結(jié)核感染(LTBI)者；然而當(dāng)機(jī)體免疫力降低時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致MTB大量增殖，引發(fā)臨床疾病。目前約有10%的潛伏性結(jié)核感染者會(huì)發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核[7]。如何快速診斷和治療，對(duì)防止結(jié)核病的傳播意義重大。

結(jié)核菌素皮試(TST)是最早用于檢測(cè)MTB感染的方法，但由于易受卡介苗和環(huán)境分枝桿菌的干擾，且在結(jié)核流行區(qū)域的靈敏度和特異度均很低，TST的作用越來越受到限制。近年來，一種利用MTB特有抗原在體外刺激外周血細(xì)胞以檢測(cè)T細(xì)胞應(yīng)答作為MTB感染的診斷方法得到了較快的發(fā)展，對(duì)檢測(cè)MTB具有很高的特異度和靈敏度，在歐美國(guó)家已經(jīng)成為結(jié)核臨床常規(guī)檢測(cè)方法之一[8]。目前該方法的實(shí)現(xiàn)方式有2種：一種為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(TB-Elispot)，另一種為體外IFN-γ釋放實(shí)驗(yàn)(TB-IGRA)。TB-IGRA方法因相對(duì)較低的設(shè)施條件要求和較好的臨床符合率而被美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(CDC)推薦作為替代TST的更優(yōu)方法。本試驗(yàn)采用3種國(guó)內(nèi)外主流的檢測(cè)試劑，對(duì)醫(yī)院確診的結(jié)核病和非結(jié)核病患者進(jìn)行檢測(cè)，擬評(píng)價(jià)不同方法對(duì)結(jié)核病診斷的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1樣本來源 評(píng)價(jià)病例樣本來自昆明市第三人民醫(yī)院、北京市老年醫(yī)院和廈門市疾病預(yù)防控制中心3家臨床研究中心，研究獲得了各臨床研究單位倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，研究中入組所有病例均與受試者簽訂了《受試者知情同意書》。三家機(jī)構(gòu)相關(guān)數(shù)據(jù)由萬泰公司提供。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn) 能夠明確的MTB感染情況的人群：包括肺結(jié)核臨床患者、肺外結(jié)核臨床患者、普通人群中的無癥狀潛伏感染者、非結(jié)核肺部疾病患者，非結(jié)核志愿者。

1.1.2.1肺結(jié)核臨床患者 診斷原則如下，具備1～6中3項(xiàng)或7～8條中任何1項(xiàng)確診為肺結(jié)核：(1)典型肺結(jié)核臨床癥狀和胸部X線表現(xiàn)；(2)抗結(jié)核治療有效；(3)臨床可排除其他非結(jié)核性肺部疾患；(4)結(jié)核菌素(PPD)試驗(yàn)(5TD)強(qiáng)陽(yáng)性，+++以上(含)；血清抗結(jié)核抗體陽(yáng)性；(5)痰結(jié)核菌PCR+探針檢測(cè)呈陽(yáng)性；(6)肺外組織病理證實(shí)結(jié)核病變；(7)BALF檢出抗酸分枝桿菌；(8)支氣管或肺部組織病理證實(shí)結(jié)核病變。

1.1.2.2肺外結(jié)核臨床患者 診斷原則如下，具備1～3中2項(xiàng)可確診：(1)PPD(5TD)強(qiáng)陽(yáng)性，+++以上(含)；(2)肺外組織病理證實(shí)結(jié)核病變；(3)抗結(jié)核治療有效。

1.1.2.3MTB隱性感染者(普通人群中的無癥狀潛伏感染者) 診斷原則如下，具備1～3中1項(xiàng)可確診：(1)PPD(5TD)強(qiáng)陽(yáng)性，+++以上(含)；(2)PPD(5TD)近期陽(yáng)轉(zhuǎn)；(3)結(jié)核病確切接觸史，接觸時(shí)間不少于12個(gè)月。

1.1.2.4無結(jié)核指征的其他疾病患者 診斷原則如下，具備1～2中2項(xiàng)可確診：(1)PPD(5TD)一般陽(yáng)性或陰性，++以下(含)，近期未出現(xiàn)陽(yáng)轉(zhuǎn)；(2)明確的非結(jié)核臨床診斷結(jié)果。

1.1.2.5無結(jié)核指征的普通人 診斷原則如下，具備1～2中1項(xiàng)可確診：(1)PPD(5TD)一般陽(yáng)性，++以下(含)，近期未出現(xiàn)陽(yáng)轉(zhuǎn)；(2)PPD(5TD)陰性；(3)臨床診斷未發(fā)現(xiàn)結(jié)核和肺部疾病。

1.1.3排除標(biāo)準(zhǔn) (1)年齡小于18歲或大于等于68歲；(2)由MTB以外的其他分枝桿菌致病的患者；(3)免疫損害者(原發(fā)性免疫缺陷性疾病、接收放化療、免疫抑制藥物治療患者)；(4)結(jié)核病合并糖尿病患者。

1.1.4樣本情況 在本研究中MTB感染者病例共875例，其中包含肺結(jié)核臨床患者721例，肺外結(jié)核臨床患者35例，結(jié)核合并其他疾病患者樣本30例，MTB隱性感染者91例；非MTB感染者共353例，其中包含無結(jié)核指征的其他疾病患者91例和無結(jié)核指征的普通人262例。本研究中入組樣本的數(shù)量和組成如表1所示。

表1 樣本基本信息表(n)

1.2儀器與試劑 MTB相關(guān)γ-干擾素檢測(cè)試劑盒(體外釋放酶聯(lián)免疫法)(TB-IGRA試劑)為北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；QuantiFERON?-TB(QFT-GIT試劑)為澳大利亞Cellestis Limited公司生產(chǎn)；T-SPOT.TB試劑由Oxford Immunotec公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀由Bio-Rad公司生產(chǎn)；DEM-3型洗板機(jī)由廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；ZXDP-B2080型37 ℃恒溫箱由上海智城分析儀器制造有限公司生產(chǎn)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將來自同一受試者的新鮮全血樣本，分別用北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的MTB相關(guān)γ-干擾素檢測(cè)試劑盒(體外釋放酶聯(lián)免疫法)和澳大利亞Cellestis Limited公司生產(chǎn)的QuantiFERON?-TB試劑盒進(jìn)行處理和檢測(cè)，同時(shí)隨機(jī)選取其中部份病例采集新鮮血并采用T-SPOT.TB試劑進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按各廠家試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。靈敏度=結(jié)核感染者中檢出陽(yáng)性例數(shù)/結(jié)核感染者樣本總數(shù)×100%。特異度=(非結(jié)核感染者樣本總數(shù)-非結(jié)核感染者中檢出陽(yáng)性例數(shù))/非結(jié)核感染者樣本總數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1TB-IGRA、QFT-GIT試劑和T-SPOT.TB試劑的比較分析 兩家試劑對(duì)875例MTB感染者樣本和353例非結(jié)合桿菌感染者樣本共計(jì)1 228例臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果如表2所示，TB-IGRA試劑診斷MTB感染的靈敏度為78.29%(685/875)，特異度為77.05%(272/353)；QFT-GIT試劑診斷MTB感染的靈敏度為74.63%(653/875)，特異度為80.74%(285/353)。TB-IGRA和QFT-GIT試劑在檢測(cè)靈敏度和特異度方面，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

在上述分析的1 228例病例中，采用T-SPOT.TB試劑對(duì)其中隨機(jī)的132例病例進(jìn)行了追蹤檢測(cè)，結(jié)果如表3所示，TB-IGRA試劑診斷MTB感染的靈敏度為72.60%(53/73)，特異度為45.76%(27/59)；QFT-GIT試劑診斷MTB感染的靈敏度為50.68%(37/73)，特異度為40.68%(24/59)；T-SPOT.TB試劑診斷MTB感染的靈敏度為58.90%(43/73)，特異度為61.02%(36/59)，TB-IGRA、QFT-GIT試劑和T-SPOT.TB試劑在檢測(cè)靈敏度和特異度方面，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 TB-IGRA與QFT-GIT試劑檢驗(yàn)結(jié)果判斷MTB感染的準(zhǔn)確性分析(n)

表3 TB-IGRA、QFT-GIT和T-SPOT.TB試劑檢驗(yàn)結(jié)果判斷MTB感染的準(zhǔn)確性分析(n)

表4 TB-IGRA、QFT-GIT試劑與PPD結(jié)果比較分析

續(xù)表4 TB-IGRA、QFT-GIT試劑與PPD結(jié)果比較分析

注：無結(jié)果為未進(jìn)行PPD檢測(cè)

2.2TB-IGRA、QFT-GIT試劑和T-SPOT.TB試劑與PPD結(jié)果比較分析 1 228例臨床病例樣本中，TB-IGRA、QFT-GIT試劑與PPD結(jié)果比較分析匯總?cè)绫?所示，PPD不同強(qiáng)弱的對(duì)象中，TB-IGRA試劑與QFT-GIT試劑的檢出率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TB-IGRA試劑、QFT-GIT試劑檢出率與PPD結(jié)果具有相關(guān)性，由弱到強(qiáng)，均呈明顯增強(qiáng)趨勢(shì)，TB-IGRA試劑和QFT-GIT試劑對(duì)PPD檢測(cè)呈陽(yáng)性的743例病例的檢出率分別為65.95%(490/743)，60.83%(452/743)。分析132例T-SPOT.TB試劑檢測(cè)的隨機(jī)病例，PPD呈陽(yáng)性病例中，TB-IGRA試劑檢出率為67.47%(56/83)，QFT-GIT試劑檢出率為48.19%(40/83)，T-SPOT.TB檢出率為54.22%(45/83)，TB-IGRA、QFT-GIT試劑和T-SPOT.TB試劑對(duì)PPD陽(yáng)性樣本的檢出率方面，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TB-IGRA檢出率高于QFT-GIT試劑和T-SPOT.TB試劑。

2.3TB-IGRA、QFT-GIT試劑與細(xì)菌培養(yǎng)、涂片結(jié)果比較分析 1 228例病例中，合計(jì)832例病例有細(xì)菌培養(yǎng)和涂片結(jié)果，TB-IGRA、QFT-GIT試劑檢測(cè)結(jié)果與細(xì)菌培養(yǎng)，涂片結(jié)果比較如表6所示。細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果不同的對(duì)象中，TB-IGRA試劑與QFT-GIT試劑的檢出率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；細(xì)菌學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性的對(duì)象中，TB-IGRA試劑和QFT-GIT試劑的檢出率均高于細(xì)菌學(xué)陰性對(duì)象。分析132例T-SPOT.TB試劑隨機(jī)檢測(cè)的病例，具備細(xì)菌培養(yǎng)和涂片結(jié)果的樣本共計(jì)45例，3家試劑與細(xì)菌培養(yǎng)、涂片結(jié)果比較如表7所示，TB-IGRA試劑與T-SPOT.TB試劑之間的檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高于QFT-GIT試劑。

表5 TB-IGRA、QFT-GIT和T-SPOT.TB試劑

注：無結(jié)果為未進(jìn)行PPD檢測(cè)

表6 TB-IGRA、QFT-GIT試劑與細(xì)菌培養(yǎng)和涂片結(jié)果比較分析

表7 TB-IGRA、QFT-GIT和T-SPOT.TB試劑與

3 討 論

目前臨床對(duì)于結(jié)核病的診斷主要依賴于臨床癥狀、影像學(xué)特征和病原學(xué)診斷?；颊吲R床癥狀和影像學(xué)特征有助于疑似患者的發(fā)現(xiàn)，但進(jìn)一步診斷需要結(jié)合病原學(xué)檢測(cè)[9-10]。MTB檢查是確診結(jié)核病最特異的方法，其中培養(yǎng)法被認(rèn)為是臨床診斷結(jié)核病最特異的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但該方法一般需2～8周方能獲得結(jié)果，靈敏度低，且易出現(xiàn)漏檢，嚴(yán)重影響結(jié)核病的早期診療[11-13]。PPD試驗(yàn)的結(jié)果是目前國(guó)內(nèi)診斷潛伏感染主要依據(jù)，一般將PPD強(qiáng)陽(yáng)性或短期內(nèi)從陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，而無臨床結(jié)核病證據(jù)者判斷為結(jié)核菌潛伏感染者。其最大的缺點(diǎn)在于PPD是從MTB中粗提的抗原混合物，其中包含很多非MTB及卡價(jià)菌(BCG)的共同抗原成分，卡介苗的接種會(huì)造成假陽(yáng)性，而人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者等自身免疫性疾病以及免疫力低下的人群中容易出現(xiàn)假陰性[14-15]。因而尋找靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短，特異度好，方便操作的MTB感染檢測(cè)試劑成為各方研究的重點(diǎn)。細(xì)胞免疫介導(dǎo)的MTB γ干擾素釋放試驗(yàn)是近年為采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定或酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法定量檢出受檢者全血或外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)MTB特異度抗原的IFN-γ檢測(cè)釋放反應(yīng)，用于結(jié)核菌潛伏感染的診斷。

在本研究中，通過對(duì)多中心臨床樣本的檢測(cè)，評(píng)價(jià)了3種檢測(cè)特異度抗原介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)試劑盒，通過對(duì)臨床入組的1 228例病例進(jìn)行檢測(cè)分析，北京萬泰的TB-IGRA試劑和澳大利亞的QFT-GIT試劑在檢測(cè)肺結(jié)核感染的靈敏度和特異度方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均顯示了較高的靈敏度，TB-IGRA試劑診斷MTB感染的靈敏度為78.29%(685/875)，特異度為77.05%(272/353)；QFT-GIT試劑診斷MTB感染的靈敏度為74.63%(653/875)，特異度為80.74%(285/353)。TB-IGRA試劑、QFT-GIT試劑陽(yáng)性率與PPD結(jié)果有相關(guān)性，由弱到強(qiáng)，均呈明顯增強(qiáng)趨勢(shì)，與PPD結(jié)果比較，TB-IGRA試劑和QFT-GIT試劑對(duì)PPD檢測(cè)呈陽(yáng)性的743例病例的陽(yáng)性檢出率分別為65.95%(490/743)，60.83%(452/743)。細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果不同的對(duì)象中，TB-IGRA試劑與QFT-GIT試劑的檢出率的差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；細(xì)菌學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性的對(duì)象中，TB-IGRA試劑和QFT-GIT試劑的檢出率均高于細(xì)菌學(xué)陰性對(duì)象。對(duì)1228例病例分析結(jié)果顯示，TB-IGRA試劑與QFT-GIT試劑對(duì)結(jié)核感染的性能一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

同時(shí)，在研究的1 228例病例中，隨機(jī)挑選了132例病例采用T-SPOT.TB試劑進(jìn)行追蹤檢測(cè)，分析此132例病例樣本檢測(cè)結(jié)果。TB-IGRA試劑、QFT-GIT試劑和T-SPOT.TB試劑在診斷MTB感染的靈敏度和特異度方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。分析132例T-SPOT.TB檢測(cè)的PPD呈陽(yáng)性的病例檢測(cè)結(jié)果，TB-IGRA、QFT-GIT試劑和T-SPOT.TB試劑對(duì)PPD陽(yáng)性樣本的檢出率方面經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TB-IGRA檢出率高于QFT-GIT試劑和T-SPOT.TB試劑。132例病例中具備細(xì)菌培養(yǎng)和涂片結(jié)果的樣本共計(jì)45例，TB-IGRA試劑與T-SPOT.TB試劑檢測(cè)出陽(yáng)性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但高于QFT-GIT試劑。

4 結(jié) 論

北京萬泰生產(chǎn)的TB-IGRA試劑與QFT-GIT和T-SPOT.TB試劑相比較，在檢測(cè)MTB感染方面性能無明顯差異。但相較于T-SPOT.TB試劑，TB-IGRA試劑與QFT-GIT試劑具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)更短、結(jié)果判讀簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，利于醫(yī)院檢驗(yàn)科室的臨床檢測(cè)使用。同時(shí)TB-IGRA試劑作為國(guó)產(chǎn)試劑，在成本方面比QFT-GIT和T-SPOT.TB試劑具備更明顯的優(yōu)勢(shì)，可為我國(guó)各級(jí)醫(yī)療衛(wèi)生單位特別是基層醫(yī)療單位的MTB感染診斷提供更大的助力。