宋小青，王革玲

(湖北江漢油田總醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北潛江 433124)

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，多發(fā)于30～50歲女性，近年來(lái)有年輕化趨勢(shì)[1]。早期宮頸癌患者常無(wú)明顯癥狀和體征，宮頸可光滑或難與宮頸柱狀上皮異位區(qū)別，此類患者多因?qū)m頸外觀正常易漏診或誤診。隨著病變發(fā)展，可出現(xiàn)陰道流血、陰道排液，甚至出現(xiàn)尿頻、尿急、便秘、下肢腫痛等晚期臨床癥狀，此時(shí)患者多已處于中晚期，預(yù)后往往較差。目前宮頸癌的診斷主要依賴宮頸刮片細(xì)胞學(xué)檢查、宮頸和宮頸管活組織檢查等病理學(xué)檢查，但上述操作均為有創(chuàng)性檢查，給患者造成了一定的痛苦，這也會(huì)導(dǎo)致人們不愿意定期進(jìn)行篩查[2]。故而，尋找有效、穩(wěn)定的生物學(xué)標(biāo)志物無(wú)疑可為宮頸癌的治療贏得時(shí)間，對(duì)提高患者生存率，改善其生存質(zhì)量具有重要意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。LncRNA是一類長(zhǎng)約200 nt的非編碼RNA，通過(guò)表觀遺傳調(diào)控參與各種生理病理過(guò)程，已被證實(shí)在前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌等泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中具有較大診斷價(jià)值[4-7]。本研究收集了130例經(jīng)病理確診的宮頸癌患者，同期收取130例宮頸炎患者和130例體檢健康女性，檢測(cè)并比較3組研究對(duì)象血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平，分析三者與宮頸癌臨床病理特征之間的關(guān)系及對(duì)宮頸癌鑒別診斷的價(jià)值，旨在為宮頸癌的早期篩查提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年8月至2018年4月在本院經(jīng)病理學(xué)/細(xì)胞學(xué)確診的宮頸癌患者130例。年齡25～54歲，平均(38.0±4.6)歲。其中鱗癌89例，腺癌25例，腺鱗癌16例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期87例，Ⅲ～Ⅳ期43例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移90例。宮頸癌的診斷、病理分型及分期依據(jù)美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)臨床實(shí)踐指南2015年第2版[8]。同期收取130例宮頸炎患者，年齡23～46歲，平均(35.9±4.1)歲。宮頸炎的診斷依據(jù)2015年美國(guó)疾病預(yù)防與控制中心(CDC)指南[9]。此外，收取130例本院體檢健康女性，年齡24～48歲，平均(36.9±4.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)宮頸癌患者未接受放化療治療；(2)意識(shí)清楚，語(yǔ)言表達(dá)能力正常，能與調(diào)查人員進(jìn)行正常的溝通；(3)與研究者進(jìn)行研究目的溝通后，研究對(duì)象自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有其他腫瘤疾病史者；(2)排除腦卒中、老年癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的無(wú)法采集相關(guān)信息和精神分裂癥的患者；(3)患者或患者家屬不愿意參與研究者。本研究的開(kāi)展經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入對(duì)象均簽署了項(xiàng)目知情同意書(shū)。

1.2臨床資料與樣本的采集 由研究人員記錄患者的年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙史、飲酒史等基本信息，BMI計(jì)算方法為體質(zhì)量/身高2(kg/m2)。使用促凝采血管收集經(jīng)禁食10 h以上宮頸癌及宮頸炎患者接受治療前和健康對(duì)照者入院體檢時(shí)的靜脈血5 mL。收集的標(biāo)本在1 h內(nèi)于4 ℃離心機(jī)(中國(guó)湘儀集團(tuán)H-1850R型)以3 500 r/min離心10 min，收集上層血清，并放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z測(cè)。

1.3血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 血清總RNA的提取按照血液RNA提取試劑盒(中國(guó)Bioteke公司)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。取上述提取的RNA，使用去除基因組逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國(guó)Takara公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)(美國(guó)Bio-Rad公司C1000型)。RT-PCR按照SYBR GREEN(中國(guó)康為世紀(jì)公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)體系為：Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，DEPC水6.4 μL。熒光定量PCR循環(huán)條件：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。內(nèi)參基因采用GAPDH。應(yīng)用PrimerPremier5.0進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)，引物序列為：LncRNA-H19上游：5′-AAT CCT TTA TGT GAC CAG AA-3′，下游：5′-CTC CTT TGT TGA ATC CAT-3′；LncRNA-ATB上游引物：5′-AGT GTG TCC TGT TCT CCC AGT-3′下游引物：5′-TGG GGG AAT CTT TCG CAT T-3′； LncRNA-UCA1上游引物：5′-AGT GTG TCC TGT TCT CCC AGT-3′下游引物：5′-TGG GGG AAT CTT TCG CAT T-3′；GAPDH上游：5′-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3′， 下游：5′-GCA GGA GGC ATT GCT GAT GAT-3′。引物合成由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司提供。采用2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNA的相對(duì)表達(dá)量，△Ct值=樣本Ct值-GAPDH Ct值。RT-PCR結(jié)果顯示，血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1和GAPDH基因熔解曲線峰型單一，說(shuō)明引物沒(méi)有形成引物二聚體，也沒(méi)有非特異性擴(kuò)增，如圖1。同時(shí)計(jì)算血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1檢測(cè)的批內(nèi)、批間變異系數(shù)，以評(píng)估實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和精確度。

注：圖A示LncRNA-H19；圖B示LncRNA-ATB；圖C示LncRNA-UCA1；圖D示GAPDH

圖1LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1和GAPDH基因熔解曲線峰型

2 結(jié) 果

2.1基本資料及血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平比較 宮頸癌患者、宮頸炎患者和體檢健康者之間在年齡、BMI、吸煙、飲酒差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與宮頸炎患者和體檢健康者相比，宮頸癌患者血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而宮頸炎患者和體檢健康者間血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1與宮頸癌臨床特征的關(guān)系 如表2所示，血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1表達(dá)水平與宮頸癌患者的年齡、BMI、吸煙、飲酒和組織學(xué)類型等因素差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而與宮頸癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(LncRNA-H19：r=0.521，P=0.006；LncRNA-ATB：r=0.505，P=0.011；LncRNA-UCA1：r=0.486，P=0.023)及患者TNM分級(jí)(LncRNA-H19：r=0.513，P=0.016；LncRNA-ATB：r=0.591，P=0.003；LncRNA-UCA1：r=0.509，P=0.007)呈線性關(guān)聯(lián)。

表1 基本資料及血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平比較

注：與宮頸癌患者比較，aP<0.05

表2 血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1與宮頸癌臨床特征的關(guān)系

表3 血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1對(duì)宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

注：a表示校正年齡、BMI、吸煙、飲酒等因素

2.3血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1對(duì)宮頸癌的鑒別價(jià)值 ROC曲線分析顯示，血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1在區(qū)分宮頸癌與宮頸炎和健康對(duì)照者的AUC分別為0.815(95%CI：0.672～0.908，P<0.001)、0.841(95%CI：0.754～0.927，P<0.001)和0.612(95%CI：0.558～0.706，P=0.002)；在各指標(biāo)約登指數(shù)為最大值時(shí)對(duì)應(yīng)的靈敏度/特異度分別為：78.5%/86.9%、78.7%/90.7%和70.2%/59.3%；診斷界值分別為8.6(-log)、28.8(-log)和9.5(-log)，見(jiàn)圖2A。聯(lián)合血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1在區(qū)分宮頸癌與宮頸炎和健康對(duì)照者的AUC為0.923(95%CI：0.893～0.974，P<0.001)，靈敏度92.3%，特異度83.4%，見(jiàn)圖2B。

2.4血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1對(duì)宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 單因素分析顯示，血清高LncRNA-H19、高LncRNA-ATB和高LncRNA-UCA1水平是宮頸癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素(P<0.05)；多因素分析顯示，在校正年齡、BMI、吸煙、飲酒等因素后，血清高LncRNA-H19、高LncRNA-ATB和高LncRNA-UCA1水平仍是宮頸癌發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表3。

注：A圖示血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1在區(qū)分宮頸癌與宮頸炎和健康對(duì)照；B圖示聯(lián)合血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1在區(qū)分宮頸癌與宮頸炎和健康對(duì)照

圖2血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-

UCA1對(duì)宮頸癌鑒別價(jià)值

3 討 論

宮頸癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高、侵襲性強(qiáng)以及預(yù)后差等特點(diǎn)，是威脅人群健康的主要疾病之一[10]。生物標(biāo)志物是血液、尿液或者組織中能檢測(cè)疾病狀態(tài)的分子指標(biāo)，可用于疾病的檢測(cè)與評(píng)估[11-12]。它們?cè)隗w液中的水平變化可以提供疾病進(jìn)展情況的相關(guān)信息，理想情況下，生物標(biāo)志物應(yīng)具有檢測(cè)早期小塊腫瘤的高靈敏度、高特異度，并且在非腫瘤中不會(huì)增加。目前，對(duì)于宮頸癌的診斷仍然缺乏有效指標(biāo)，導(dǎo)致這類患者預(yù)后較差，而生物標(biāo)志物的早期檢測(cè)可顯著提高宮頸癌患者的生存率。

近年來(lái)，關(guān)于LncRNAs在宮頸癌領(lǐng)域的相關(guān)功能學(xué)研究逐漸成為新的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了近10種LncRNAs與宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等過(guò)程有關(guān)。例如，PENG等[13]對(duì)419例宮頸癌患者的一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果表明，LncRNA-H19表達(dá)水平與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、TNM分期等密切相關(guān)，且高水平的LncRNA-H19提示更差的臨床預(yù)后。隨后研究發(fā)現(xiàn)其可能的機(jī)制是LncRNA-H19可誘導(dǎo)腫瘤組織高表達(dá)癌基因HOXA11，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[14]。LncRNA-ATB也被證實(shí)參與宮頸癌的發(fā)病過(guò)程。CAO等[15]對(duì)50對(duì)宮頸癌及癌旁組織中LncRNA-ATB的表達(dá)進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，癌組織中LncRNA-ATB表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，提示LncRNA-ATB對(duì)鑒別診斷宮頸癌具有潛在價(jià)值，進(jìn)一步利用永生化宮頸癌Hela細(xì)胞系進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，LncRNA-ATB可通過(guò)TGF-β途徑誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的耐藥，并增強(qiáng)其侵襲能力。除LncRNA-H19與LncRNA-ATB外，近年來(lái)關(guān)于LncRNA-UCA1與宮頸癌的研究也有一定進(jìn)展。例如，F(xiàn)ANG等[16]的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LncRNA-UCA1可作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA取代miR-184并上調(diào)DUSP7表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)病。FAN等[17]發(fā)現(xiàn)，LncRNA-UCA1在宮頸癌等多種腫瘤組織中均呈高表達(dá)狀態(tài)，而靶向抑制LncRNA-UCA1則可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，并降低其遷移能力。上述研究結(jié)果提示，LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1可通過(guò)多種途徑參與宮頸癌的發(fā)病過(guò)程，而三者的異常表達(dá)可能為宮頸癌的早期診斷提供線索，但目前國(guó)內(nèi)外鮮有關(guān)于聯(lián)合上述3種LncRNA與宮頸癌診斷的相關(guān)報(bào)道。

在本次研究中，筆者探究了血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值，并分析了三者與宮頸癌臨床病理特征之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明，宮頸癌患者血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平較宮頸炎及健康對(duì)照者顯著增高，該研究結(jié)果與前期多個(gè)研究結(jié)果相符[13-17]。聯(lián)合3項(xiàng)指標(biāo)診斷宮頸癌的靈敏度高達(dá)92.3%，顯著高于單項(xiàng)指標(biāo)靈敏度，表明聯(lián)合檢測(cè)血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1診斷宮頸癌具有一定價(jià)值，可考慮在臨床推廣使用。此外，本研究再次證實(shí)，LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1表達(dá)水平與宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)，Logistic回歸多因素分析顯示，在校正年齡、BMI、吸煙、飲酒等因素影響后，血清高LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平仍是宮頸癌發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，上述這些結(jié)論與前期國(guó)外研究結(jié)果相一致[14-15,17]，表明LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1表達(dá)水平對(duì)宮頸癌患者腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后有一定預(yù)測(cè)作用。然而，本次研究仍有以下不足：(1)本次研究納入的患者均來(lái)自于本院，這可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果造成一定的偏倚影響，今后需要多中心的隊(duì)列研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證研究結(jié)果；(2)本研究納入130例宮頸癌患者，患者的例數(shù)仍然有限，后期需要更大樣本量的研究來(lái)證實(shí)血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1在我國(guó)宮頸癌患者中的臨床價(jià)值。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1對(duì)宮頸癌的診斷及發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中具有潛在價(jià)值，有望為宮頸癌的臨床診療提供新思路。