鄭 毅，趙友云△，湯 琪，黃 潔，譚 婕，李玉波

(1.湖北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)藥大學(xué)教務(wù)處，湖北武漢 430065；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

肥胖已成為重要的社會(huì)和健康問(wèn)題，它作為一種復(fù)雜的疾病，它由多種基因和環(huán)境因素共同影響，例如能量不均衡、生活方式、基因和家族史、藥物、吸煙、年齡等。近年來(lái)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)肥胖的理論研究越來(lái)越熱門(mén)，其中FTO基因是已經(jīng)被廣泛確認(rèn)的肥胖相關(guān)基因之一。有研究表明，F(xiàn)TO基因上的SNP位點(diǎn)突變與肥胖的發(fā)生有密切關(guān)系[1-2]。另一方面，中醫(yī)體質(zhì)學(xué)認(rèn)為體質(zhì)與疾病具有相關(guān)性[2-4]，疾病的發(fā)生與預(yù)后的共同基礎(chǔ)是患者的體質(zhì)基礎(chǔ)，體質(zhì)決定了發(fā)病與否與發(fā)病的傾向性[5]。本研究，擬將現(xiàn)代西方醫(yī)學(xué)認(rèn)為的肥胖機(jī)理-基因突變與傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為的中醫(yī)體質(zhì)結(jié)合起來(lái)，找出二者的關(guān)系。本研究的目的是找出中醫(yī)體質(zhì)分型的科學(xué)理論依據(jù)，探索中醫(yī)體質(zhì)類(lèi)型與超重、肥胖的關(guān)系，從而為從中醫(yī)調(diào)整體質(zhì)的角度防控肥胖提供幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 一般資料選取2016年11月至2017年3月在湖北省中醫(yī)院體檢中心就診的48例18歲以上的健康人群作為對(duì)照組，健康人群經(jīng)測(cè)量身高、體質(zhì)量，其身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)在18.50～24.99 kg/m2的正常范圍內(nèi)，并排除有心、腦、肝和造血系統(tǒng)等系統(tǒng)原發(fā)性疾病和糖尿病急性并發(fā)癥的患者。對(duì)照組中，男26例，女22例，平均年齡43.45歲，平均身高1.73 m，平均體質(zhì)量63.45 kg，平均BMI 21.20 kg/m2，平均全身脂肪含量(FM)14.03 kg，平均體脂百分比(PBF)22.12%。另選取2016年8月至2017年1月在湖北省中醫(yī)院內(nèi)科就診的52例18歲以上的肥胖人群作為肥胖組，經(jīng)測(cè)量身高、體質(zhì)量，其BMI大于30.00。肥胖組中，男27例，女25例，平均年齡45.57歲，平均身高1.71 m，平均體質(zhì)量93.10 kg，平均BMI 33.83 kg/m2，平均全身脂肪含量(FM)31.89 kg，平均體脂百分比(PBF)32.30%。兩組別在年齡、性別、吸煙者構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。分組原則是遵循世界衛(wèi)生組織制定的基于BMI梯度劃分的正常、超重和肥胖的范圍。BMI值小于18.5 kg/m2的人群被認(rèn)為體質(zhì)量過(guò)輕；BMI大于25 kg/m2被認(rèn)為超重；BMI大于30 kg/m2被認(rèn)為肥胖。

1.2方法

1.2.1對(duì)照組與肥胖組基本資料的測(cè)量 48例對(duì)照組、52例肥胖組人群嚴(yán)格按照BMI和FM按照嚴(yán)格的人體測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)量，即身高體質(zhì)量用標(biāo)準(zhǔn)身高體質(zhì)量測(cè)量?jī)x測(cè)量。脂肪含量由Hologic Delphi X射線(xiàn)吸收DXA掃描儀測(cè)量(Hologic Corporation,Waltham,MA,USA)。其中BMI的測(cè)量精密度變異系數(shù)為0.2%，F(xiàn)M的測(cè)量精密度變異系數(shù)為1.3%。

1.2.2DNA提取 完成上述測(cè)量之后，所有對(duì)照組、肥胖組標(biāo)本均抽取3 mL外周靜脈血。對(duì)臨床樣本取2 mL全血提取外周血單核細(xì)胞，DNA提取使用QIAamp DNA Blood Midi Kit，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。DNA提取后，使用紫外風(fēng)光光度儀測(cè)量其OD260/280比值。上述DNA模板，使用無(wú)菌水重懸，并儲(chǔ)存在-70 ℃[6-7]。

1.2.3肥胖組人群的中醫(yī)分型 中醫(yī)體質(zhì)分型按照全國(guó)肥胖病研究學(xué)術(shù)會(huì)議制定的中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)[8]，按照“肝郁氣滯型、脾虛濕阻型、胃熱濕阻型、脾腎兩虛型、陰虛內(nèi)熱型”進(jìn)行分類(lèi)判讀，并計(jì)算頻率。

1.2.4iMLDR引物設(shè)計(jì) 采用改良多重高溫連接酶檢測(cè)反應(yīng)(iMLDR)技術(shù)，PCR擴(kuò)增引物和連接引物均由上海生工技術(shù)有限公司合成，SNP位點(diǎn)檢測(cè)由上海天昊生物科技有限公司合成。引物信息如下，見(jiàn)表1。

1.2.5PCR擴(kuò)增、LDR連接反應(yīng) 依據(jù)單重?zé)晒舛縋CR體系優(yōu)化及擴(kuò)增效率，反應(yīng)體系為4 mM MgCl2，0.48 mM dNTP，0.5U Taq DNA聚合酶，0.29 μM上游引物，0.29 μM下游引物和5 μL DNA模板，加ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s， 65 ℃ 45 s， 72 ℃ 45 s， 10個(gè)循環(huán)； 94 ℃ 30 s， 65 ℃ 30 s， 72 ℃ 50 s 30個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 5 min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化進(jìn)行iMLDR連接反應(yīng)，總體系為20 μL：高溫連接酶0.5 μL、5′連接引物混合液1 μL，3′連接引物混合液，純化后的PCR產(chǎn)物5 μL，連接酶緩沖液2 μL，加ddH2O至20 μL[9-11]。

表1 iMLDR引物信息

1.2.6檢測(cè)基因型 取1 μL連接產(chǎn)物與1 μL內(nèi)標(biāo)和9 μL甲酰胺混勻后，94 ℃變性3 min后，在ABI3500(美國(guó)ABI)上進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序。數(shù)據(jù)經(jīng)GeneMapper 4.0軟件處理，再上傳至Genebank Blast比對(duì)，可直接判讀其基因型[12]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)表示。將相關(guān)因素的統(tǒng)計(jì)內(nèi)容作為變量，不同組之間的比較采用χ2進(jìn)行單因素分析，對(duì)FTO基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)rs9939609、rs1421085、rs8057044分別進(jìn)行χ2檢驗(yàn)驗(yàn)證是否符合Hardy-Weinberg平衡。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1肥胖組人群的中醫(yī)體質(zhì)分型 由一位副主任中醫(yī)醫(yī)師按照《中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)肥胖組人群進(jìn)行體質(zhì)分型結(jié)果如下。52例肥胖組人群中，按照中醫(yī)體質(zhì)分類(lèi)人數(shù)由多到少依次為：肝郁氣滯型、脾虛濕阻型、胃熱濕阻型、脾腎兩虛型、陰虛內(nèi)熱型。在年齡、性別、FM、PBF方面，5種中醫(yī)癥候之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其中在分型的過(guò)程中，還發(fā)現(xiàn)3種復(fù)合體質(zhì)：肝郁氣滯+胃熱濕阻；脾虛濕阻+胃熱濕阻；肝郁氣滯+陰虛內(nèi)熱[13]。見(jiàn)表2。

2.2Hardy-Weinberg平衡的吻合度檢驗(yàn) 如表3所示，rs9939609位點(diǎn)的等位基因及基因型分布在對(duì)照組(χ2=4.349，P=0.077)和肥胖組(χ2=3.121，P=0.140)符合哈迪溫伯格平衡。rs1421085位點(diǎn)的等位基因及基因型分布在對(duì)照組(χ2=4.134，P=0.088)和肥胖組(χ2=2.619，P=0.120)符合哈迪溫伯格平衡。rs8057044位點(diǎn)的等位基因及基因型分布在對(duì)照組(χ2=1.989，P=0.746)和肥胖組(χ2=0.186，P=0.671)符合哈迪溫伯格平衡。選取的人群樣本的基因型頻率符合隨機(jī)性原則，研究對(duì)象具有人群的代表性。

表2 肥胖人群中醫(yī)體質(zhì)分型結(jié)果

注：-表示無(wú)數(shù)據(jù)

表3 FTO基因3個(gè)SNP位點(diǎn)的Hardy-

續(xù)表3 FTO基因3個(gè)SNP位點(diǎn)的Hardy-

2.3對(duì)照組與肥胖組的等位基因頻率比較 針對(duì)rs9939609(A/T)存在3種可能的基因型即：AA純合子/AT雜合子/TT純合子。48例對(duì)照組中，TT、AT、AA的表達(dá)頻率分別為77.08%、20.83%、2.08%；A基因的頻率為18.96%、T基因的頻率為81.03%。52例肥胖組中，TT、AT、AA的表達(dá)頻率分別為82.69%、9.61%、7.69%；A基因的頻率為15.78%、T基因的頻率為84.21%?；蛐图暗任换虻母怕式?jīng)χ2檢驗(yàn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.230、1.330)。

針對(duì)rs1421085(C/T)存在3種可能的基因型即：CC純合子/CT雜合子/TT純合子。48例對(duì)照組中，TT、CT、CC的表達(dá)頻率分別為66.66%、27.08%、6.25%；C基因的頻率為22.41%、T基因的頻率為77.58%。52例肥胖組中，TT、AT、AA的表達(dá)頻率分別為71.15%、19.23%、9.61%；A基因的頻率為29.85%、T基因的頻率為70.15%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析，C基因及CC+CT基因型分布頻率高于對(duì)照組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.042、0.046)。

針對(duì)rs8057044(A/G)存在3種可能的基因型即：AA純合子/AG雜合子/GG純合子。48例對(duì)照組中，GG、AG、AA的表達(dá)頻率分別為83.33%、8.33%、8.33%；A基因的頻率為15.38%、G基因的頻率為84.62%。52例肥胖組中，GG、AG、AA的表達(dá)頻率分別為50.00%、36.53%、13.46%；A基因的頻率為36.62%、G基因的頻率為63.38%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析，A基因及AA+AG基因型分布頻率高于對(duì)照組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023、0.018)。見(jiàn)表4。

表4 基因型分布和等位基因頻率比較[n(%)]

表5 SNP位點(diǎn)基因型在中醫(yī)癥候中的分布(n)

2.4中醫(yī)肥胖癥候與FTO基因SNP位點(diǎn)突變間的關(guān)系比較 統(tǒng)計(jì)在rs9939609、rs1421085、rs8057044基因在中醫(yī)肥胖癥候中的分布情況可以發(fā)現(xiàn)，rs9939609的A基因即突變基因在除脾腎兩虛型中未分布外，在其他四型中均有分布，未見(jiàn)明顯偏向性。rs1421085的C基因即突變基因從表5中可見(jiàn)，在脾虛濕阻型中大量分布，CT基因型占61.53%，CC基因型占23.08%，此外CC基因型在脾腎兩虛型和陰虛內(nèi)熱型中未見(jiàn)分布。rs8057044的A基因即突變基因在脾腎兩虛型大量分布。AG基因型占50%，AA基因型占50%；A基因同樣在陰虛內(nèi)熱型中大量分布，AG基因型占75%，AA基因型占25%，此外GG基因型在這2種癥候中未見(jiàn)分布。見(jiàn)表5。

3 討 論

肥胖是一種典型的復(fù)雜疾病，它會(huì)引起很多健康問(wèn)題，如冠心病、2型糖尿病、高血壓、膽結(jié)石等等。但如何判斷一個(gè)人是否肥胖的標(biāo)準(zhǔn)，有很多的方法。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)公認(rèn)的方法是測(cè)量BMI。癥候是中醫(yī)理論的核心內(nèi)容，也是眾多中醫(yī)現(xiàn)代化研究的關(guān)鍵問(wèn)題之一。因此，盡快為中醫(yī)體質(zhì)分型尋找理論依據(jù)顯得尤為關(guān)鍵[14]。中醫(yī)系統(tǒng)內(nèi)部的癥候辨證方法不一，證型繁多?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)承認(rèn)的大致有數(shù)十種之多，除本文提到的5種外，還有胃腸實(shí)熱、氣血瘀滯、寒濕凝滯、陰虛血燥等，其中不少證型是名異而實(shí)同[15-16]。中醫(yī)藥在改善肥胖病癥狀和改善患者生活質(zhì)量方面具有巨大潛力，但現(xiàn)代西方醫(yī)學(xué)認(rèn)為中醫(yī)癥候分型缺乏說(shuō)服力。本研究證明了肝郁氣滯型、脾虛濕阻型、胃熱濕阻型在肥胖人群中較多分布，但5種體質(zhì)在肥胖程度上未見(jiàn)明顯差異。

本研究所選取的3個(gè)FTO基因的SNP位點(diǎn)rs9939609、rs1421085、rs8057044是目前公認(rèn)的與肥胖高度相關(guān)SNP位點(diǎn)，國(guó)內(nèi)也有不少學(xué)者針對(duì)上述位點(diǎn)做了研究[17]。rs9939609位點(diǎn)中的基因型分布在對(duì)照組和肥胖組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，rs1421085、rs8057044的突變基因的頻率在肥胖組中明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。故本文認(rèn)為rs9939609不適合作為本地區(qū)人群的肥胖突變位點(diǎn)。且rs9939609與5種中醫(yī)體質(zhì)分布無(wú)明顯關(guān)系，結(jié)果還表明rs1421085與脾虛濕阻型、rs8057044與脾腎兩虛型和陰虛內(nèi)熱型高度相關(guān)。

4 結(jié) 論

本文采用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法iMLDR探索了5種中醫(yī)體質(zhì)與肥胖基因SNP位點(diǎn)間的關(guān)系，結(jié)果表明：FTO基因的rs9939609的A基因在肥胖組和對(duì)照組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可加大樣本量研究此位點(diǎn)是否適用于黃種人肥胖基因分型，且不推薦作為中醫(yī)體質(zhì)分型的指標(biāo)；rs1421085與脾虛濕阻型高度相關(guān)，rs8057044與脾腎兩虛型和陰虛內(nèi)熱型高度相關(guān)。