史躍燕，鞠少卿，申嫻娟，張金業(yè)，朱自力，顧益鳳

(1.南通市腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南通 226000；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院外科綜合實(shí)驗(yàn)室，江蘇南通 226000)

宮頸癌(CC)是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，并且發(fā)病率有升高的趨勢。據(jù)報(bào)道，中國每年新確診的病例約為13萬例，占全球28.8%[1]。研究表明人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染和基因突變是宮頸癌發(fā)生的重要因素[2]。

微小核糖核酸(miRNA)是一種小分子非編碼單鏈RNA，在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié)基因方式呈網(wǎng)狀，即一個(gè)miRNA可調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因，一個(gè)基因也可由多個(gè)miRNA調(diào)節(jié)。有文獻(xiàn)報(bào)道稱，人類基因的1/3由miRNA調(diào)控[3]。miRNA結(jié)合位點(diǎn)的SNP能使信使RNA靶基因的功能發(fā)生改變，從而使得癌癥更加易發(fā)并能推進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[4]。已有研究表明，在亞洲人中，miRNA單核苷酸的多態(tài)性與患癌風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性更加明顯[5]。因此，miRNA可作為腫瘤輔助診斷、疾病監(jiān)測、療效評價(jià)及腫瘤形成機(jī)制研究的潛在腫瘤標(biāo)志物[6]。同時(shí)研究表明，外周血中的miRNA反復(fù)凍融、酸堿處理及長期保存等均能穩(wěn)定存在[7]，為miRNA的血清學(xué)研究提供了可能性。故許多學(xué)者認(rèn)為血清miRNA的這些生物學(xué)特性可用于宮頸癌的早期診斷、療效監(jiān)測、機(jī)制研究及靶向治療。

有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-200家族通過對目的基因的調(diào)控影響腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲等生物學(xué)過程，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8]。張占薪等[9]的研究表明宮頸癌組織has-miRNA-200b表達(dá)水平明顯高于癌旁宮頸組織。本文通過分析55例CC患者、32例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)患者、39例子宮肌瘤患者及47例健康對照者的血清樣本hsa-miR-200a-3p表達(dá)水平的變化，探討其在宮頸癌輔助診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 本次實(shí)驗(yàn)所有血清標(biāo)本均來自南通市腫瘤醫(yī)院，患者為2015年11月至2016年6月收治的未經(jīng)任何治療的初診住院患者，55例CC患者：年齡34～84歲，平均57歲；32例CIN患者：年齡28～80歲，平均47歲；39例子宮肌瘤患者：年齡33～86歲，平均50歲；47例健康對照：年齡22～61歲，平均43歲。所有患者均經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實(shí)，入院前未經(jīng)任何放化療及抗腫瘤治療。健康對照納入標(biāo)準(zhǔn)：血糖、血脂、肝腎功能均無異常、無婦科疾病及其他并發(fā)癥的體檢者，各組間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者知情同意。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集及血清總RNA提取 用真空采血法采集各研究對象的空腹肘靜脈血，自然凝固后離心1 000 r/min離心10 min，將上層血清分裝于無核糖核酸酶的EP管中，唯一性編號，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆??？俁NA提取用北京百泰克生物技術(shù)有限公司(BioTeke Corporation)試劑盒提取，純度經(jīng)分光光度計(jì)測定合格后逆轉(zhuǎn)成cDNA。

1.2.2RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)cDNA 將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)cDNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、hsa-miR-200a-3p及內(nèi)參U6莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物分別由美國Thermo公司、上海捷瑞生物科技有限公司提供。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：RNA 300 ng，5×緩沖液 4 μL，10 μM莖環(huán)狀逆轉(zhuǎn)錄引物1 μL，dNTP(10 nM)2 μL，核糖核酸酶抑制劑(20 U/μL)1 μL，反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)1 μL，無核酸酶水補(bǔ)足至20 μL。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定 hsa-miR-200a-3p正向引物：5′-GCG CCT AAC ACT GTC TGG TAA-3′，hsa-miR-200a-3p反向引物：5′-CAG CCA CAA AAG AGC ACA AT-3′；U6正向引物：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，U6反向引物：5′-TGG TGT CGT GGA GTC G-3′，反應(yīng)體系為：SYBR GreenⅠmix(Rox)10 μL，cDNA4 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，無核酸酶水5 μL，混勻后短暫離心。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；58 ℃，32 s，40個(gè)循環(huán)，hsa-miR-200a-3p和內(nèi)參U6均做3個(gè)復(fù)孔，取均值，hsa-miR-200a-3p的相對表達(dá)水平(RQ)用2-△△Ct法表示，△△Ct=實(shí)驗(yàn)組(CtmiRNA均值-CtU6均值)-對照組(CtmiRNA均值-CtU6均值)。SYBR GreenⅠ染料和7500實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀分別來自德國羅氏(Roche)公司和美國ABI公司。

1.2.4血清糖鏈抗原125(CA125)和人鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原(SCCAg)測定 分別采用德國羅氏(Roche)診斷有限公司的E601化學(xué)發(fā)光儀和深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司的Maglumi全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀測定CA125和SCCAg水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析運(yùn)用SPSS21.0軟件；數(shù)據(jù)用[M(P25，P75)]表示；多個(gè)獨(dú)立樣本比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，多樣本兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman分析；用受試者工作特征曲線(ROC曲線)獲得cut-off值，并評價(jià)各檢測指標(biāo)的診斷價(jià)值；檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1hsa-miR-200a-3p的相對表達(dá)量 CC、CIN患者、子宮肌瘤患者和健康對照者血清hsa-miR-200a-3p的相對表達(dá)量分別為1.871(1.124，5.096)、1.638(0.615，3.875)、0.980(0.522，1.760)和0.891(0.495，1.600)。CC患血清hsa-miR-200a-3p的相對表達(dá)量者高于子宮肌瘤患者和健康對照者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；CIN患者血清hsa-miR-200a-3p的相對表達(dá)量者高于子宮肌瘤患者和健康對照者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與CIN患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。子宮肌瘤患者和健康對照者h(yuǎn)sa-miR-200a-3p的相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 血清hsa-miR-200a-3p在CC組、CIN組、子宮肌瘤組

2.2CC患者血清hsa-miR-200a-3p相對表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系 CC患者血清hsa-miR-200a-3p的相對表達(dá)量在不同年齡、絕經(jīng)與否、腫瘤最大直徑及FIGO分期間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

2.3血清hsa-miR-200a-3p相對表達(dá)量與糖類抗原125(CA125)、SCCAg的相關(guān)性分析 CC患者血清hsa-miR-200a-3p相對表達(dá)量與CA125、SCCAg之間無相關(guān)性(r2=0.012，P=0.421；r2=0.004，P=0.647)。見圖2、3。

2.4ROC曲線分析 CC患者和子宮肌瘤患者比較，hsa-miR-200a-3p的cut-off值為1.784，ROC曲線下面積(AUC)為0.753[95%置信區(qū)間(CI)：0.675～0.850]，診斷效能見圖4。CC患者和健康對照者比較，hsa-miR-200a-3p的cut-off值為1.502、AUC為0.771(95%CI：0.682～0.860)。診斷效能見圖5。

表1 CC患者血清hsa-miR-200a-3p的相對表達(dá)量

圖2 CC患者血清hsa-miR-200a-3p的相對

圖3 CC患者血清hsa-miR-200a-3p的相對

圖4 CC患者區(qū)分于子宮肌瘤時(shí)各指標(biāo)的ROC曲線

圖5 CC患者區(qū)分于健康對照時(shí)各指標(biāo)的ROC曲線

表3 區(qū)分于健康對照者時(shí)各指標(biāo)對CC診斷

2.5hsa-miR-200a-3p、CA125和SCCAg聯(lián)合檢測診斷CC的價(jià)值 ROC曲線分析表明，在區(qū)分CC和子宮肌瘤時(shí)，hsa-miR-200a-3p和SCCAg的靈敏度和特異度均相似，而CA125的特異度僅為12.8%，聯(lián)合前兩者檢測的靈敏度和特異度分別為78.2%和79.5%，此時(shí)聯(lián)合檢測hsa-miR-200a-3p和SCCAg更合適。在區(qū)分CC和健康對照時(shí)，hsa-miR-200a-3p和SCCAg靈敏度相同，且高于CA125，SCCAg特異度最高。在單項(xiàng)檢測中SCCAg的診斷準(zhǔn)確率最高，SCCAg聯(lián)合hsa-miR-200a-3p的診斷準(zhǔn)確率高于SCCAg聯(lián)合CA125。見表2、3。

3 討 論

CC的早期發(fā)病癥狀隱匿，對于未定期進(jìn)行宮頸篩查的女性很難及時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)出現(xiàn)明顯癥狀而就診時(shí)往往處于癌癥中晚期，其療效和預(yù)后均不理想。研究表明，miRNA在CC組織中的升高或降低與CC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[10]。

miR-200a屬于miR-200家族成員，在不同的腫瘤中發(fā)揮不同的作用，與miR-141有著共同的序列“AACACU”。其中miR-200a、miR-200b及miR-429基因簇位于人體的1號染色體p36.33區(qū)，而miR-200c和miR-141基因簇位于人體的12號染色體p13.31區(qū)，這2個(gè)區(qū)域容易發(fā)生染色體缺失、易位或點(diǎn)突變，進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

miR-200家族可抑制E盒結(jié)合鋅指蛋白1(ZEB1)和ZEB2的表達(dá)從而抑制腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變，最終抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲過程。miR-200a下調(diào)ZEB2的表達(dá)進(jìn)而抑制CD133/1+鼻咽癌細(xì)胞和卵巢癌干細(xì)胞的遷移和侵襲[11-12]。miR-200a能夠?qū)CAM1mRNA的3′-UTR進(jìn)行負(fù)調(diào)控，從而導(dǎo)致NCAM1基因所編碼的NCAM-120、NCAM-140和NCAM-180蛋白水平下調(diào)[13]。張占薪等[9]研究表明CC組織中has-miRNA-200b的表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CAO等[14]研究表明miR-200a、miR-200b和miR-200c在上皮性卵巢癌組織中處于明顯高表達(dá)狀態(tài)，并與生存期呈負(fù)相關(guān)。miR-200家族在胃癌組織中的呈低表達(dá)水平狀態(tài)，與正常對照組織之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)[15]。因此可以認(rèn)為，miR-200家族對不同的腫瘤發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。

本次研究通過對55例CC患者、32例CIN患者、39例子宮肌瘤患者和47例健康對照者血清hsa-miR-200a-3p的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：CC患者和CIN患者血清hsa-miR-200a-3p的相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CC組和子宮肌瘤患者、健康對照者血清hsa-miR-200a-3p的相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；CIN患者和子宮肌瘤患者、健康對照者血清hsa-miR-200a-3p的相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；子宮肌瘤患者和健康對照者血清hsa-miR-200a-3p的相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

通過對血清hsa-miR-200a-3p的表達(dá)水平與臨床病例特征之間關(guān)系的研究表明，其相對表達(dá)量在不同年齡、絕經(jīng)與否、腫瘤最大直徑及FIGO分期之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

本研究結(jié)果提示，CC患者血清hsa-miR-200a-3p水平升高，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定CC患者血清中的hsa-miR-200a-3p水平對CC具有一定的輔助診斷價(jià)值，在單獨(dú)診斷時(shí)診斷效能低于SCCAg，高于CA125，聯(lián)合hsa-miR-200a-3p和SCCAg，可提高對CC的診斷效能。hsa-miR-200a-3p可能成為CC診斷的重要血清標(biāo)志。

大多數(shù)CC由CIN轉(zhuǎn)變而來，CC重要的危險(xiǎn)因素是高危型HPV的長期感染。研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、MMP2在HPV陽性CC細(xì)胞中水平明顯高于HPV陰性細(xì)胞，miR-200a的高表達(dá)可導(dǎo)致MMP2的表達(dá)水平升高[16]，在本研究中，CIN患者的hsa-miR-200a-3p水平也升高，因而可以設(shè)想hsa-miR-200a-3p可能參與由HPV感染引起宮頸病變的過程，為進(jìn)一步闡明CC的發(fā)生機(jī)制及CC的預(yù)防和治療提供新思路。

4 結(jié) 論

CC患者血清hsa-miR-200a-3p的相對表達(dá)量高于子宮肌瘤患者和健康對照者，有可能成為CC輔助診斷的重要生物學(xué)指標(biāo)，血清hsa-miR-200a-3p的表達(dá)水平或可用于CIN的輔助診斷。