林 靜，孫志鵬，李 娟，肖娜娜，哈小琴△

(1.上海市東方醫(yī)院南院檢驗(yàn)科，上海 200123;2.希森美康醫(yī)用電子(上海)有限公司學(xué)術(shù)應(yīng)用部，上海 200120；3.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院檢驗(yàn)科，甘肅蘭州 730050)

彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)，是在許多疾病基礎(chǔ)上，致病因素?fù)p傷微血管體系，導(dǎo)致凝血活化，全身微血管血栓形成，凝血因子大量消耗并繼發(fā)纖溶亢進(jìn)，引起以出血及微循環(huán)衰竭為特征的臨床綜合征[1]。DIC患者發(fā)病的嚴(yán)重程度不一，有的臨床癥狀及體征不明顯，甚至實(shí)驗(yàn)室檢查都很難發(fā)現(xiàn)；但有的患者起病急驟，發(fā)展迅速，預(yù)后極差，病死率可高達(dá)31%～86%[2-3]，這一情況在急診病房中特別明顯。因此，早期、準(zhǔn)確的診斷和及時(shí)給予正確的治療措施顯得尤為重要[4-6]。

DIC的發(fā)生常常存在基礎(chǔ)疾病，包括嚴(yán)重感染、惡性腫瘤、產(chǎn)科、白血病、創(chuàng)傷和藥物等，有研究發(fā)現(xiàn)，感染及惡性疾病是產(chǎn)生DIC的主要疾病，二者約占DIC病因的2/3[7]。而感染引起的DIC早中期主要為凝血功能激活，抗凝功能和纖溶功能受抑制，后期大量纖維蛋白形成，激活纖溶系統(tǒng)。臨床較理想的監(jiān)測(cè)指標(biāo)應(yīng)有如下特征：可對(duì)DIC的發(fā)生做早期的預(yù)警、對(duì)臨床進(jìn)程可進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)估、可精確的指導(dǎo)治療。目前國(guó)內(nèi)外研究者提出了4個(gè)診斷DIC的診斷標(biāo)準(zhǔn)：包括國(guó)際血栓與止血協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[1](ISTH)、日本衛(wèi)生福利部標(biāo)準(zhǔn)[1](JMHW)、日本急診醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[1](JAAM)和2017年DIC診斷中國(guó)專家共識(shí)[7]，都無(wú)法滿足臨床的要求。本研究擬應(yīng)用新型電化學(xué)發(fā)光監(jiān)測(cè)即監(jiān)測(cè)代表內(nèi)皮細(xì)胞功能的血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)和纖溶酶-抗纖溶酶復(fù)合物(t-PAIC)，代表凝血酶激活的凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物(TAT)，直接代表纖溶活性的組織型纖溶酶原激活物-纖溶酶原激活抑制復(fù)合物(PIC)來(lái)輔助診斷DIC，希望發(fā)現(xiàn)這些指標(biāo)能進(jìn)一步提高臨床的診斷率和指導(dǎo)預(yù)后判斷。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院2016年8月至2017 年12月收錄急診重癥監(jiān)護(hù)室的患者，存在感染的基礎(chǔ)疾病，如胰腺炎，膿毒血癥，嚴(yán)重創(chuàng)傷等。排除嚴(yán)重血液系統(tǒng)疾病、腫瘤、孕產(chǎn)婦、嚴(yán)重心臟病，自身免疫性疾病、嚴(yán)重肝病、腎病等。本次研究共收錄符合標(biāo)準(zhǔn)的患者111例，其中男78例，女33例，年齡18～86歲，平均(54.1±14.40)歲。按《彌散性血管內(nèi)凝血診斷中國(guó)專家共識(shí)(2017版)》中的標(biāo)準(zhǔn)[7]，非惡性血液病≥7分可診斷為DIC，將患者分成DIC組(41例)和非DIC組(70例)。DIC組中，男25例，女16例，年齡中位數(shù)為51.0歲；非DIC組中，男53例，女17例，年齡中位數(shù)為60.5歲。兩組年齡、性別分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 臨床醫(yī)生懷疑DIC時(shí)采血，0.3 mL 3.2%的檸檬酸鈉管抽取2.7 mL全血，1∶9抗凝。血液3 000 r/min離心10 min，將上層血漿轉(zhuǎn)移到新離心管，分離血漿于30 min內(nèi)-80 ℃凍存。所有樣本1次37 ℃水浴復(fù)溶后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2儀器及試劑 TM、TAT、t-PAIC、PIC 所用儀器為Sysmex化學(xué)發(fā)光儀器HISCL-5000，試劑為配套化學(xué)發(fā)光試劑，檢測(cè)變異系數(shù)(CV)值<3%。血漿凝血酶原時(shí)間(PT)、纖維蛋白原(FIB)、D-二聚體(D-D)使用儀器為Sysmex CS-5100 凝血分析儀，試劑為配套試劑，血小板(PLT)使用儀器為Sysmex XE-2100血球分析儀，使用配套試劑。

1.2.3檢測(cè)方法 TM、TAT、t-PAIC、PIC 使用化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定法，是通過(guò)將樣本和試劑混勻在一起進(jìn)行加溫，依次發(fā)生免疫反應(yīng)和酶反應(yīng)。通過(guò)計(jì)數(shù)酶反應(yīng)中發(fā)出的光子計(jì)數(shù)，迅速地自動(dòng)測(cè)定樣本中的待測(cè)物的水平。PT、FIB采用凝固法，即光線照射到血漿和試劑的混合物，渾濁度變化(在纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白時(shí))可通過(guò)散射光的變化檢測(cè)出來(lái)，以光度變化到50%的程度作為凝固終點(diǎn)。D-D采用免疫比濁法，是特異性抗體致敏的乳膠微粒與待測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗原相遇時(shí)發(fā)生凝集反應(yīng)，使反應(yīng)混合物系統(tǒng)的濁度變小，透射光增強(qiáng)。乳膠凝集程度與被測(cè)物的濃度呈正相關(guān)，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，可推測(cè)出標(biāo)本中待測(cè)物的相對(duì)水平。PLT采用阻抗法檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)錄入及統(tǒng)計(jì)使用IBM SPSS21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。數(shù)據(jù)使用M(P25～P75)表示，兩組樣本間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。受試者工作特征曲線(ROC曲線)判斷診斷效能，以尤登指數(shù)最大處決定檢驗(yàn)項(xiàng)目的cut-off值，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組患者凝血標(biāo)志物的情況 DIC組患者的纖溶標(biāo)志物TM、PIC和t-PAIC水平均高于非DIC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而TAT值雖然低于非DIC組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1，圖1。從凝血標(biāo)志物在各組的分布情況看，DIC組的PT和D-D水平高于非DIC組，F(xiàn)IB和PLT值低于非DIC組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.2TM、PIC、t-PAIC診斷DIC的ROC曲線相關(guān)參數(shù) TM、PIC、t-PAIC 診斷DIC的ROC曲線相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表3。PIC的靈敏度最高為89.3%，聯(lián)合檢測(cè)后特異度達(dá)到了95.7%。

表1 兩組患者血清中TM、TAT、PIC和t-PAIC的水平[M(P25～P75)]

表2 兩組患者常用指標(biāo)的結(jié)果[M(P25～P75)]

圖1 兩組患者血清中TM、TAT、PIC和t-PAIC的水平

檢測(cè)項(xiàng)目AUCP95%置信區(qū)間(CI)cut-off靈敏度(%)特異度(%)TM0.7160.0010.585～0.84724.950 U/mL60.781.0PIC0.8610.0000.768～0.9542.836 μg/mL89.382.8t-PAIC0.8190.0000.718～0.92113.100 ng/mL71.487.9聯(lián)合檢測(cè)0.8660.0000.788～0.923-65.995.7

注：聯(lián)合檢測(cè)為T(mén)M、PIC和t-PAIC聯(lián)合檢測(cè)，-表示無(wú)數(shù)據(jù)

3 討 論

DIC不是一種獨(dú)立的疾病，是許多疾病共同發(fā)展時(shí)凝血功能障礙，后期進(jìn)展可伴隨休克、多器官功能衰竭，病死率極高，臨床醫(yī)生需要掌握能快速診斷DIC的實(shí)驗(yàn)室輔助檢查手段，早期發(fā)現(xiàn)，早期治療?，F(xiàn)今，尚無(wú)單一的特異的DIC監(jiān)測(cè)指標(biāo)，本次研究對(duì)DIC的判定主要用了多種常規(guī)凝血指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，包括PLT計(jì)數(shù)、PT、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、FIB、D-D等。據(jù)報(bào)道，在DIC早期PT和APTT可能處于正常水平，而炎性反應(yīng)通?？蓪?dǎo)致FIB增加，因此診斷DIC的特異度較低[8-9]。在DIC的發(fā)生過(guò)程受影響的纖溶系統(tǒng)物質(zhì)有：纖溶酶原、纖溶酶、纖溶酶原激活物[尿激酶型纖溶酶原激活劑(u-PA)、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)]、纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)和α2-抗纖溶酶[10]等，但由于半衰期短，很多指標(biāo)無(wú)法直接檢測(cè)。

嚴(yán)重感染是引發(fā)DIC最常見(jiàn)的基礎(chǔ)疾病，臨床和實(shí)驗(yàn)資料表明多數(shù)DIC的發(fā)生通過(guò)組織因子(TF)激活外源性凝血途徑實(shí)現(xiàn)的[11-12]。正常情況下，與血液接觸的血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞等不表達(dá)TF，而在感染的病理情況下，內(nèi)皮細(xì)胞作為內(nèi)毒素的靶細(xì)胞，由于釋放氧自由基與溶酶而損傷內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)和釋放TF，同時(shí)還刺激機(jī)體產(chǎn)生、釋放大量炎癥因子和細(xì)胞因子，誘導(dǎo)TF、PAI-1的表達(dá)，抑制抗凝物質(zhì)的活化，抑制纖溶的發(fā)生[13-14]。TM是內(nèi)皮細(xì)胞表面的凝血酶的受體，抑制凝血酶的活性，增強(qiáng)PC的活化性能，該指標(biāo)是內(nèi)皮細(xì)胞活化的標(biāo)志。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，將t-PA釋放到血液，將在肝臟釋放到血液中的纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，血液中的t-PA與生理性抑制因子PAI-1迅速1∶1結(jié)合，形成復(fù)合物t-PAIC。本研究發(fā)現(xiàn)，DIC組的TM和t-PAIC水平高于非DIC組，2個(gè)指標(biāo)均表明內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而刺激TF的表達(dá)[12]，因此TM和t-PAIC水平的升高對(duì)DIC的早期診斷有一定的意義。

TF的釋放激活了外源凝血途徑，發(fā)生凝血激活，形成凝血酶，將纖維蛋白原轉(zhuǎn)變程纖維蛋白而形成血栓。TAT是凝血酶與其代表性抑制因子抗凝血酶以1∶1結(jié)合形成的復(fù)合物，其升高表明凝血酶產(chǎn)生量多，即處于凝血激活狀態(tài)，換而言之，其正常可以認(rèn)為凝血沒(méi)有激活。與孟英等[15]的研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)DIC組與非DIC組的TAT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，咨詢臨床發(fā)現(xiàn)可能與其使用了肝素抗凝有關(guān)，當(dāng)醫(yī)生懷疑DIC時(shí)，盡管沒(méi)有達(dá)到診斷標(biāo)準(zhǔn)，也會(huì)預(yù)先使用抗凝藥物來(lái)預(yù)防，而這種方法可能導(dǎo)致患者出血增加，希望通過(guò)進(jìn)一步的研究指導(dǎo)醫(yī)生使用抗凝藥物。本次研究因?yàn)闃颖玖坑邢?，無(wú)法統(tǒng)計(jì)未使用抗凝藥物時(shí)TAT的變化情況，期待后續(xù)的實(shí)驗(yàn)?zāi)苓M(jìn)一步研究。

凝血系統(tǒng)激活后，纖溶酶將纖維蛋白和纖維蛋白原降解成D-D和纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)，其增高意味著凝血激活、血栓形成，而且血栓發(fā)生了溶解，因此可以認(rèn)為D-D和FDP為凝血和纖溶同時(shí)激活的標(biāo)志。D-D雖然是診斷DIC的敏感指標(biāo)，其升高容易受到底物量、血循環(huán)、炎癥、代謝等因素的影響[16]，很多時(shí)候都處于較高水平。而PIC是纖溶酶與α2抗纖溶酶1∶1結(jié)合的復(fù)合物，只反映纖溶酶的情況，因此根據(jù)PIC的變化來(lái)評(píng)價(jià)體內(nèi)纖溶激活程度，希望以后可以指導(dǎo)抗纖溶的治療。本研究結(jié)果顯示，DIC發(fā)生時(shí)，PIC水平顯著升高，提示纖溶系統(tǒng)激活。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，TM和t-PAIC水平的升高可以反映早期DIC發(fā)生時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷情況，而PIC水平顯著升高可以提示機(jī)體的纖溶系統(tǒng)被激活，采用TM、PIC和t-PAIC的聯(lián)合檢測(cè)，其特異度可以達(dá)到95.7%，可以作為較好的DIC診斷指標(biāo)。