李博研，張 卓，周 波，郭連瑩，王曉紅，于 葉，胡博森

(沈陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧省高等學(xué)校環(huán)境與人口健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110034)

自然界中，氟元素常以氟化物的形式穩(wěn)定存在。在高氟環(huán)境條件下，機(jī)體長期過量攝入氟化物，可使其在體內(nèi)廣泛蓄積，最終導(dǎo)致慢性氟中毒。在我國，氟中毒是危害較為嚴(yán)重的一種地方病，屬于全身中毒性疾病，除了可以引起以骨代謝紊亂為典型特征的氟骨癥，還可造成肝、腎及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等非骨相組織的功能異常[1-3]。目前，氟中毒病因已明確，雖然其致病機(jī)制尚未完全清楚，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為[1,4-5]，氟的毒性損傷作用與機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)密不可分。本研究通過對正常大鼠和慢性氟中毒模型大鼠的比較，主要從形態(tài)學(xué)角度觀察氟化鈉引起實(shí)驗(yàn)大鼠骨相和非骨相組織的病理學(xué)改變，為探討氟中毒的毒性機(jī)理、深入研究氟中毒器官組織損傷及其防治措施提供基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

20只斷乳4周齡，體重65～75 g，清潔級SD大鼠(雌雄各半)購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部[SCXK(遼)2013-0001]。常規(guī)喂養(yǎng)1周后，根據(jù)體重均衡的原則將大鼠隨機(jī)分為對照組和氟中毒組，每組10只(雌雄各半，分籠飼養(yǎng))。對照組飲用自來水(F-濃度：0.4536 mg/L)，氟中毒組飲用含氟化鈉(NaF)的自來水(F-濃度：100 mg/L)；兩組大鼠均喂飼市售普通顆粒飼料。實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物室[SYXK(遼)2013-0007]進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)共持續(xù)12周，期間，保持動物室良好通風(fēng)，室溫20℃～25℃，相對濕度(60±10)%，實(shí)驗(yàn)大鼠自由攝食、攝水，定期稱重，并觀察日?；顒訝顟B(tài)。按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

HITACHI H-7650透射電鏡(日本日立公司)；SpectraMax Plus384高通量酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；CSB-F-1型氟離子選擇電極(長沙半導(dǎo)體材料廠)。氟化鈉(Sigma，USA)；東盛牌普通飼料(沈陽市于洪區(qū)前民飼料廠)；多聚甲醛(上海圻明生物科技有限公司)；戊二醛(上海雙博生物科技有限公司)；四氧化鋨(北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司)；檸檬酸鉛(北京達(dá)昱科儀科技有限公司)；丙二醛試劑盒(南京建成生物工程研究所)；考馬斯亮蘭試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束，各組大鼠稱重，測量身長、尾長，采用大鼠氟斑牙分度方法[6]記錄氟斑牙發(fā)生情況。隨后，所有大鼠麻醉后，腹主動脈采血，分離血清，處死后，迅速分離股骨、肝、腎及腦組織，除股骨外，同一臟器取相同部位組織進(jìn)行MDA含量測定；每組抽取6只大鼠(雌雄各半)組織樣本，用于氟含量測定；另取雌雄大鼠各1只組織樣本，用于光鏡標(biāo)本制備和觀察；剩余2只大鼠組織樣本用于電鏡標(biāo)本制備。具體按下列步驟進(jìn)行操作：

1.3.1 氟含量測定

參照相關(guān)文獻(xiàn)方法，骨組織中氟含量采用管式爐高溫燃燒水解法進(jìn)行測定[7]，軟組織氟含量采用氟離子選擇電極法進(jìn)行測定[8]。

1.3.2 MDA含量測定

血清中MDA含量按照說明書進(jìn)行操作，MDA(nmol/mL)=(測定管的OD值-測定空白管的OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管的OD值-標(biāo)準(zhǔn)空白管的OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品的濃度×稀釋倍數(shù)。組織中MDA含量測定，首先準(zhǔn)確稱取待測組織的重量，按照重量體積比加預(yù)冷生理鹽水，使用勻漿器在冰上操作將標(biāo)本勻漿充分，制成10%的組織勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清液，再按照說明書要求進(jìn)行操作，MDA(nmol/mgprot)=(測定管的OD值-測定空白的OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管的OD值-標(biāo)準(zhǔn)空白管的OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度/樣品蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 光鏡標(biāo)本制備

各組織樣本均用4%多聚甲醛固定72 h(股骨固定后需用10% EDTA脫鈣)。固定結(jié)束后，流水沖洗3 h。石蠟常規(guī)包埋后，機(jī)械切片，伊紅-蘇木素普通染色，顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.3.4 電鏡標(biāo)本制備

取股骨干骺端松質(zhì)骨塊，其他組織取相同部位組織塊，均用2.5%的戊二醛溶液固定24 h(骨組織需EDTA脫鈣)。小心清洗后，用1%的四氧化鋨溶液固定，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，機(jī)械加工制備超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動物一般狀況

實(shí)驗(yàn)期間，氟中毒組大鼠攝食量、攝水量、體重、身長及尾長均略低于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。氟中毒組大鼠行為表現(xiàn)未見明顯異常。

2.2 氟斑牙發(fā)病情況

對照組大鼠未見氟斑牙發(fā)生，表現(xiàn)為門齒生長發(fā)育良好，牙面為棕黃色，表面光滑有光澤，透明度好無破損。氟中毒組大鼠氟斑牙發(fā)病率為100%，出現(xiàn)不同程度的氟斑牙，其中輕度4只、中度5只、重度1只，表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)初期大鼠門齒出現(xiàn)棕白橫紋，后期橫紋加重，齒面著色不勻，部分區(qū)域呈白堊狀改變，牙面粗糙，光澤減退，重者出現(xiàn)破損，見表2和圖1。

2.3 各組大鼠組織中氟含量

表3結(jié)果顯示，氟中毒組大鼠骨氟、肝氟、腎氟及腦氟含量均顯著高于對照組大鼠(P<0.01)。

2.4 各組大鼠不同組織中MDA含量

氟中毒組大鼠血清及肝、腎、腦組織中MDA含量均顯著高于對照組大鼠(P<0.01或P<0.05)，見表4。

表1 各組大鼠一般狀況Table 1 General conditions of the rats in each group

表2 各組大鼠氟斑牙發(fā)生情況(n=10)Table 2 Incidence of dental fluorosis of rats in each group

注：A：正常；B：輕度；C：中度；D：重度。圖1 各組大鼠氟斑牙情況Note. A， Normal. B， Mild. C， Moderate. D， severe.Figure 1 Dental fluorosis of rats in each group

2.5 光鏡下各組織的病理學(xué)改變

光鏡結(jié)果顯示，對照組大鼠骨小梁致密完整，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)排列均勻、整齊；氟中毒組大鼠骨小梁粗細(xì)不均，小梁間距增大、髓腔擴(kuò)大，有部分?jǐn)嗔寻l(fā)生(圖2 a,b)。對照組肝組織輪廓清楚，肝細(xì)胞索排列有序，胞漿紅染，細(xì)胞核大、圓且居中；氟中毒組大鼠肝細(xì)胞部分水腫明顯，肝細(xì)胞索排列紊亂，胞漿結(jié)構(gòu)疏松，肝細(xì)胞輪廓不清(圖2 c,d)。對照組大鼠腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞排列整齊，核圓形，染色質(zhì)分布均勻，腎小球囊壁完整，系膜細(xì)胞和足細(xì)胞未見異常；氟中毒組大鼠腎皮質(zhì)近曲小管可見上皮細(xì)胞腫脹、溶解、壞死，管腔增大，腔內(nèi)可見脫落的上皮細(xì)胞(圖2 e,f)。對照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列正常、邊緣清晰，核圓居中；氟中毒組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞腫脹、空泡化，部分細(xì)胞核濃染、固縮，頂樹突排列紊亂(圖2g,h)。

2.6 電鏡下各組織的病理學(xué)改變

電鏡下可見，對照組成骨細(xì)胞核形狀完整、核仁明顯，胞質(zhì)內(nèi)含大量細(xì)胞器，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富；氟中毒組大鼠的成骨細(xì)胞胞漿成分減少，輕度核固縮、呈不規(guī)則型、核仁消失，染色質(zhì)濃聚邊集，多數(shù)線粒體發(fā)生腫脹，部分呈現(xiàn)空泡化(圖3 a,b)。對照組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞界限清晰，細(xì)胞核圓且位置居中，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，線粒體呈橢圓形，線粒體嵴連續(xù)清晰；氟中毒組大鼠肝細(xì)胞變形，細(xì)胞界限不清，染色質(zhì)濃縮邊集，在核膜下成新月形改變，細(xì)胞內(nèi)廣泛線粒體明顯腫脹，嵴斷裂或消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張(圖3 c,d)。對照組大鼠腎近曲小管上皮細(xì)胞核圓，位于中心，細(xì)胞周圍排列細(xì)長而密集的微絨毛，線粒體豐富、嵴膜清晰、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)；氟中毒組大鼠細(xì)胞腫脹，線粒體普遍腫大，線粒體嵴減少或消失，成空泡狀，個別線粒體膜破裂，細(xì)胞核染色質(zhì)邊集，核膜褶皺，并出現(xiàn)斷裂(圖3 e,f)。對照組大鼠腦神經(jīng)元細(xì)胞核大而圓，細(xì)胞核膜的雙層結(jié)構(gòu)較為清晰，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，胞漿中細(xì)胞器含量豐富且分布正常；氟中毒組大鼠神經(jīng)細(xì)胞膜褶皺，線粒體變形、嵴消失、空泡形成，染色質(zhì)固縮、濃染(圖3 g,h)。

表3 各組大鼠組織氟含量Table 3 Changes in tissue fluoride of rats in each group

注：與對照組比較，**P<0.01。

Note. Compared with the control group，**P<0.01.

表4 各組大鼠不同組織中MDA含量Table 4 MDA content in different tissues of the rats in each group

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group，*P<0.05，**P<0.01.

注：對照組：a，股骨；c，肝臟；e，腎臟；g，腦海馬區(qū)。氟中毒組：b，股骨；d，肝臟；f，腎臟；h，腦海馬區(qū)。圖2 實(shí)驗(yàn)大鼠各組織病理學(xué)改變Note. Control group: a, femur; c, liver; e, kidney; g, hippocampus. Fluorosis group: b, femur; d, liver; f, kidney; h, hippocampus.Figure 2 Histopathological changes in different tissues of the rats in each group

注：對照組：a，成骨細(xì)胞；c，肝細(xì)胞；e，腎臟近曲小管上皮細(xì)胞；g，腦神經(jīng)元。氟中毒組：b，成骨細(xì)胞；d，肝細(xì)胞；f，腎臟近曲小管上皮細(xì)胞；h，腦神經(jīng)元。圖3 實(shí)驗(yàn)大鼠各組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Note. Control group: a, osteoblast; c, hepatocyte; e, epithelial cells of proximal convoluted tubules; g, cerebral neuron. Fluorosis group: b,osteoblast; d, hepatocyte; f, epithelial cells of proximal convoluted tubules; h, cerebral neuron.Figure 3 Ultrastructural changes of different organ tissues in the rats

3 討論

氟化物在自然環(huán)境中廣泛存在，可通過經(jīng)口攝入、皮膚接觸及呼吸吸入等多種途徑進(jìn)入機(jī)體[9]。絕大部分經(jīng)口攝入的氟化物可由消化系統(tǒng)迅速吸收入血，最終以離子狀態(tài)分布全身[10-11]，主要集中在骨骼和牙齒，其余部分可在肝、腦、腎等軟組織中蓄積[11-13]，當(dāng)含量達(dá)到一定程度即可引起相應(yīng)組織病理學(xué)改變，導(dǎo)致氟中毒。地方性氟中毒在我國分布廣泛，飲水型氟中毒是其主要形式之一，考慮到相似的攝入途徑，結(jié)合相關(guān)研究結(jié)果[1,9-11]，本實(shí)驗(yàn)通過給予大鼠飲用含氟量較高的自來水制備氟中毒大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氟中毒大鼠出現(xiàn)不同程度的氟斑牙，且骨、肝、腎及腦組織中氟含量均顯著增加，說明氟中毒模型制備成功，此外，氟中毒大鼠還伴有組織MDA水平增高，及光鏡下顯著的病理學(xué)改變，可見，高氟攝入已引起實(shí)驗(yàn)大鼠組織病理性損傷。

氟對骨組織的損傷呈多種病理狀態(tài)[17-18]，通常，氟在低劑量條件下可激活成骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨作用，而高劑量條件下則抑制成骨過程。本次實(shí)驗(yàn)觀察到，氟中毒大鼠骨小梁呈現(xiàn)粗細(xì)不均、間距增大和部分?jǐn)嗔训裙琴|(zhì)疏松樣改變，這與鄭冬冬等[19]的研究結(jié)果相似；作為機(jī)體的主要代謝器官，肝和腎在氟性細(xì)胞損傷作用中首當(dāng)其沖，動物實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)，過量氟攝入可導(dǎo)致肝腎組織的結(jié)構(gòu)和功能異常[1]；此外，氟亦可穿過血腦屏障進(jìn)入腦組織，對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，進(jìn)而影響腦功能，干擾正常的記憶和思維能力[20]，本實(shí)驗(yàn)中，氟中毒大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)的細(xì)胞腫脹、空泡化等形態(tài)學(xué)變化，可為腦功能異常提供病理學(xué)解釋。

近些年，多數(shù)研究認(rèn)為[21-22]，氧化應(yīng)激主導(dǎo)了氟中毒狀態(tài)下機(jī)體的損傷作用，而組織細(xì)胞氧化損傷時又多伴有細(xì)胞凋亡的典型特征，如細(xì)胞核染色質(zhì)邊集、線粒體腫脹等。在此過程中，作為脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，MDA常用作反映組織細(xì)胞氧化損傷程度的首選指標(biāo)[23]。結(jié)合本次研究結(jié)果，氟中毒組大鼠血清及各組織中MDA水平明顯升高，這就提示氟中毒大鼠正處于相對嚴(yán)重的氧化應(yīng)激狀態(tài)。而這種氧化應(yīng)激狀況的產(chǎn)生，可能涉及下列因素[24-26]：①氟能與某些抗氧化酶中的金屬元素形成復(fù)合物，該抗氧化酶的活性部分喪失；②氟化物在生物代謝中可形成部分有機(jī)氟，去烷基后便可形成氟自由基；③過量的氟通過激活膜結(jié)合酶，催化原子氧，導(dǎo)致抗氧化酶消耗量劇增；④電負(fù)性極強(qiáng)的氟元素，可以直接攻擊氧，細(xì)胞氧代謝紊亂，自由基產(chǎn)生。因此，學(xué)者們普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激是氟中毒所致的細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。本研究電鏡結(jié)果顯示，氟中毒大鼠的成骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎近曲小管上皮細(xì)胞及腦神經(jīng)元均呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)特征，如細(xì)胞核固縮、核仁消失，染色質(zhì)濃集，線粒體腫脹、空泡化等，這也印證了上述觀點(diǎn)。只是，氟對機(jī)體的損傷機(jī)制錯綜復(fù)雜，而氟性氧化損傷作用在其中占有多大比重，亟待進(jìn)一步研究探討。

總之，氟化鈉可引起實(shí)驗(yàn)性大鼠骨、肝、腎及腦組織病理性損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。