邢 進(jìn)，岳秉飛，趙德明

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京100193；2. 中國(guó)食品藥品檢定研究院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京102629)

嗜肺巴斯德桿菌(Pasteurellapneumotropica, Pp)是一種革蘭氏陰性球桿菌，主要引起嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及兔的肺炎、中耳炎、結(jié)膜炎等炎癥，以及局部化膿性病變[1]。常與其他病原微生物，如仙臺(tái)病毒、支原體等合并感染導(dǎo)致動(dòng)物死亡。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其設(shè)施內(nèi)污染后很難去除，給飼養(yǎng)管理和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)帶來(lái)了非常多的干擾。我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中要求無(wú)特定病原體(SPF)以上級(jí)別的動(dòng)物必須要排除Pp[2]，規(guī)定采用分離培養(yǎng)和生化鑒定的方法檢測(cè)Pp，但并未要求區(qū)分不同基因型的菌株[3]。目前美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫(kù)中，Pp標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 35149和ATCC 12555，即Jawetz和Heyl生物型已經(jīng)分別重新分類為Rodentibacterpneumotropicus和Rodentibacterheylii[4]。據(jù)此，原Pp被分為了兩個(gè)完全不同的菌，根據(jù)現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法將二者進(jìn)行區(qū)分。因此應(yīng)根據(jù)實(shí)際的致病力及危害重新評(píng)估Pp菌株的檢測(cè)范圍，對(duì)Pp的檢測(cè)方法做出相應(yīng)的修改。

為提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率，本實(shí)驗(yàn)室此前對(duì)北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Pp分離株進(jìn)行過(guò)表型分析[5]，在實(shí)際檢測(cè)中，PCR及熒光定量PCR檢測(cè)方法也得到了較多的研究和應(yīng)用[6]。由于分類的改變，原有概念下的Pp需要重新定義和鑒別。了解動(dòng)物種群中Pp新的菌株感染分布將有助于對(duì)R.pneumotropicus和R.heylii的準(zhǔn)確檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)對(duì)Pp感染菌株的多態(tài)性研究。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(Amplified length polymorphism PCR，AFLP)是在PCR的基礎(chǔ)上擴(kuò)增限制性酶切后的基因組DNA限制性片段，形成特定的DNA譜帶[7]。Nattawooti等[8]成功的采用單酶切AFLP(SE-AFLP)方法對(duì)多殺巴斯德桿菌進(jìn)行了分子流行病學(xué)分析，顯示AFLP的區(qū)別能力略高脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)。本文借助雙酶切AFLP方法，對(duì)北京地區(qū)為主的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的Pp分離株進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，旨在幫助追溯污染源，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制提供依據(jù)，同時(shí)為Pp檢測(cè)方法的修訂及細(xì)菌分類研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌種

Pp標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 12555，ATCC 35149，購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保藏中心(ATCC)。Pp分離株314株，分離自2005年～2017年，23個(gè)生產(chǎn)或使用單位(S1～S23)的小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、沙鼠和犬。

1.2 主要試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、MseⅠ和Cutsmart緩沖液(NEB)；PCR試劑(TAKARA)；T4 DNA連接酶(TAKARA)。

A2級(jí)生物安全柜(NUAIR-NU-437-400S)、核酸提取儀(Qiagen QIAcubeHT)、超微量紫外分光光度計(jì)(Implen NanoPhotometer)、恒溫培養(yǎng)箱(Thermo IGS180)、PCR儀(ABI Veriti96)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 接頭和選擇性引物

通過(guò)網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)[9]模擬篩選，選擇4堿基的高頻內(nèi)切酶MseⅠ和6堿基的低頻內(nèi)切酶EcoRⅠ對(duì)Pp菌株進(jìn)行雙酶切的AFLP遺傳多態(tài)性分析。對(duì)選擇性引物進(jìn)行配對(duì)，EcoRⅠ+(ATCG)與MseⅠ+(ATCG)兩兩配對(duì)，共16中配對(duì)方式，篩選出效果最佳的引物組合。

EcoRⅠ接頭1∶5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’、EcoRⅠ接頭2∶5’-AATTGGTACGCAGTCTAC-3’；MseⅠ接頭1∶5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’、MseⅠ接頭2∶5’- TACTCAGGACTCAT-3’；選擇性引物EcoRⅠ：[FAM]-5’-GACTGCGTACC AATTCC-3’，MseⅠ：5’-GATGAGTCCTGAGTAAC-3’由生工生物工程(上海)股份有限公司合成[10]。

1.3.2 接頭制備

(一)反應(yīng)體系

200 μL 50 μmol/LMseⅠ接頭連接：100 μL 100 μmol/LMseⅠ接頭1，100 μL 100 μmol/LMseⅠ接頭2Tris-HCL(pH 8.0)，2 μL 5 mol/L NaCl，0.4 μL 0.5 mol/L EDTA；200 μL 5 μmol/LEcoRⅠ接頭連接：10 μL 100 μmol/LEcoRⅠ接頭1，10 μL 100 μmol/LEcoRⅠ接頭2，2 μL 1 mol/L Tris-HCL (pH 8.0)，2 μL 5 mol/L NaCl，0.4 μL 0.5 M EDTA，175.6 μL滅菌去離子水。

(二)反應(yīng)條件

95°C 2 min；95°C降至25°C，每分鐘降低1°C；反應(yīng)結(jié)束后置于-20°C凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 基因組DNA的提取

使用DNA提取試劑盒提取所有菌株基因組DNA，用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，要求濃度不低于20 ng/μL。

1.3.4 限制性酶切

EcoR Ⅰ 5 U，MseⅠ 5 U，酶切緩沖液4.4 μL，DNA 5 μL，加滅菌去離子水至40 μL，置 37°C水浴1 h。

1.3.5 接頭與酶切產(chǎn)物的連接

10×T4連接緩沖液1 μL，EcoR Ⅰ接頭(5 μmol/L)1 μL，MseⅠ接頭(50 μmol/L)1 μL，T4連接酶2 U，滅菌去離子水7 μL，上步酶切產(chǎn)物40 μL，37°C連接3 h。

1.3.6 選擇性擴(kuò)增

(一)反應(yīng)體系

10×PCR buffer(含Mg2+)2 μL，5 mmol/L dNTPs1 6 μL，MseⅠ+C(10 μmol/L)0.5 μL，EcoRⅠ+C(10 μmol/L)0.5 μL，TaqHS DNA聚合酶1 U， 20倍稀釋酶切連接產(chǎn)物2 μL，補(bǔ)水至20 μL。

(二)擴(kuò)增條件

94℃ 變性2 min；第一階段循環(huán)94℃ 20 s，66℃ 30 s(下降1 ℃/循環(huán))，72℃ 1 min，10個(gè)循環(huán)；第二階段循環(huán)94℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72℃ 1 min，20個(gè)循環(huán)；60℃延伸 30 min[11-12]。

1.4 多態(tài)性分析

選擇性引物EcoRⅠ經(jīng)FAM熒光素標(biāo)記后，AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物可經(jīng)毛細(xì)管電泳掃描條帶大小，1200 LIZ(ABI GeneScan)作為標(biāo)準(zhǔn)參考，形成峰圖和虛擬條帶圖譜。將峰圖導(dǎo)入Bionumerics 7.5分析軟件進(jìn)行分析，采用Dice相關(guān)系數(shù)分析方法和非加權(quán)組平均法(UPGMA)繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Band matching Tolerance和Optimization設(shè)置為1%。對(duì)相似度≥75%的指紋圖譜定義為相同基因簇(Clusters)；相似度≥99%的為相同基因型。AFLP方法的分辨力用辛普森多樣性指數(shù)D(Simpson’s index of diversity)表示[13]。

2 結(jié)果

2.1 Pp分離株的多態(tài)性

EcoRⅠ和MseⅠ的雙酶切AFLP后，經(jīng)毛細(xì)管電泳分析，獲得314株分離株及2株標(biāo)準(zhǔn)菌株的毛細(xì)管電泳峰圖(如圖1a，b)，形成的多態(tài)性條帶數(shù)量在2～80之間，大部分集中在31～36條，共有210株(見(jiàn)圖2)。使用Bionumerics軟件繪制出系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，為縮小篇幅，將分型相同的菌株合并，不同分型的菌株僅保留1株(見(jiàn)圖3)。所有菌株被分為了11個(gè)基因簇(AC1～AC11)，基因簇AC7所占比例最高，有284株，占比90.4%，涵蓋23個(gè)單位和所有6種宿主動(dòng)物。其他基因簇菌株為30株，占比9.6%，涵蓋11個(gè)單位的小鼠和大鼠(見(jiàn)表1)。

在11個(gè)基因簇中共存在190個(gè)基因型(A1～A190)，辛普森多樣性指數(shù)D為0.992?；蛐妥疃嗟臑锳76(14株)，分離自6個(gè)單位的小鼠、大鼠和豚鼠；其次為A68(11株)，分離自2個(gè)單位的小鼠；A78和A88均有10株，前者分離自4個(gè)單位的小鼠，后者分離自7個(gè)單位的小鼠、大鼠和犬，以上菌株均屬于基因簇AC7。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 12555和ATCC 35149的多態(tài)性條帶分別為25和27(見(jiàn)圖1b)，分屬于基因簇AC7和AC8，兩個(gè)基因簇的相似度為71%。2015年的小鼠分離株P(guān)P326與ATCC 12555相似度最高，達(dá)到94.5%；2009年的小鼠分離株P(guān)P043與ATCC 35149相似度最高，為92.3%。

圖1a 毛細(xì)管電泳峰圖(分離株P(guān)P005)Figure 1a Capillary electrophoresis profiles(isolate PP005 AFLP)

圖1b 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 12555和ATCC 35149 AFLP的毛細(xì)管電泳峰圖Figure 1b Capillary electrophoresis profiles of the reference strains ATCC 12555 and ATCC 35149 AFLP

圖2 菌株條帶數(shù)分布圖Figure 2 Distribution of Pp isolates fragments.

注：S1～S23代表23個(gè)動(dòng)物來(lái)源單位。

Note. S1 - S23 represent 23 animal sources.

2.3 不同來(lái)源菌株的多態(tài)性

在23個(gè)動(dòng)物來(lái)源中，S1所含基因簇和基因型最多，共6個(gè)基因簇，104個(gè)基因型；其次是S3，有4分基因簇，29個(gè)基因型。相反，S16、S19、S21和S22都只存在1個(gè)基因型的菌株。基因型A59存在于7個(gè)分離地中，感染范圍最廣；其次是基因型A71，存在于6個(gè)分離地；基因型A65、A66、A89和A111分離自三個(gè)單位，A23、A30、A33、A61、A68、A85、A89、A98、A117和A171等均分離自兩個(gè)單位(見(jiàn)圖3)。

2.4 不同時(shí)間、不同動(dòng)物間菌株的多態(tài)性

在所有菌株中，共有278株分離自小鼠，包含了所有11個(gè)基因簇AC1～AC11；有23株分離自大鼠，包含基因簇AC3、AC7和AC8；5株豚鼠分離株、2株地鼠分離株、4株沙鼠分離株及2株犬分離株，均屬基因簇AC7。有15株分離自免疫缺陷小鼠(BALB/c-nu、SCID)，基因簇為AC7。

在2005年～2017年近11年中，分離到的Pp基因型數(shù)量在5～49個(gè)之間。以2011年最多，其次為2016年的43個(gè)基因型(見(jiàn)表2)。

3 討論

本研究建立的Pp-AFLP方法，經(jīng)酶切、接頭連接和選擇性擴(kuò)增，產(chǎn)物在100～800 bp范圍內(nèi)產(chǎn)生的多態(tài)性條帶可通過(guò)毛細(xì)管電泳分析，可快速獲得Pp的多態(tài)性圖譜。獲得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中Pp感染的遺傳多態(tài)性有助于了解Pp在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其設(shè)施間的流行特征，據(jù)此制定有效的防控措施控制污染的發(fā)生。同時(shí)根據(jù)多態(tài)性條帶，AFLP能夠作為分離菌株的輔助鑒別方法。當(dāng)基因型差別較大時(shí)，需重新對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行考量。

研究中涉及的Pp菌株絕大部分只引起宿主的隱性感染，個(gè)別菌株合并感染仙臺(tái)病毒、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌或支原體時(shí)才出現(xiàn)臨床癥狀，符合以往對(duì)該菌的認(rèn)知。

部分菌株分離自不同的時(shí)間、不同的來(lái)源、不同的動(dòng)物及品系，但所獲得的多態(tài)性圖譜完全相同(如圖4)。其中最早的菌株在2005年收集，最晚的菌株在2016年，時(shí)間跨度長(zhǎng)，表明Pp基因可能非常穩(wěn)定，不易變異。此外，基因型A71可能是本地流行較為廣泛的基因型，可同時(shí)感染小鼠、大鼠和豚鼠，也或者不同來(lái)源的動(dòng)物之間發(fā)生了交叉污染。S1存在多種Pp基因型菌株，表明不同年份的菌株型別不同，提示該動(dòng)物來(lái)源設(shè)施內(nèi)存在多種Pp污染源。

本次受試的大部分菌株對(duì)嚙齒動(dòng)物的感染沒(méi)有明顯選擇性，少數(shù)菌株顯示出感染的專一性。基因簇AC8中的大鼠分離株就表現(xiàn)出親大鼠的特性(見(jiàn)圖5)，證明某些Pp菌株對(duì)不同動(dòng)物的選擇性，即在大鼠體內(nèi)的小鼠源菌株會(huì)被大鼠源的菌株競(jìng)爭(zhēng)性去除，在大鼠體內(nèi)只會(huì)存在大鼠源菌株[14]。兩株犬的分離株與一些小鼠、大鼠分離株的基因型相同，這些菌株分離自不同的來(lái)源單位，分離時(shí)間在2015年至2016年前后，可能此時(shí)北京地區(qū)存在該菌型的普遍流行，或這些單位受到了外界的污染。

注：標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 12555和ATCC 35149在圖中基因型分別為A132和A177。圖3 Pp分離株188個(gè)基因型的AFLP系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Note. The genotypes of the reference strains ATCC 12555 and ATCC 35149 were A132 and A177 respectively.Figure 3 Phylogenetic tree and AFLP profiles of 188 genotypes of Pp isolates.

年份Years基因型和基因簇Gene genotypes and clusters小鼠Mouse大鼠Rat豚鼠Guinea pig地鼠Hamster沙鼠Gerbil犬DogAC1～AC11AC3,AC7,AC8AC7AC7AC7AC72005A24,A65,A71,A104,A111/////2006A45,A57,A65,A69,A71,A104～A105,A111,A149-A150A41,A71,A143,A154////2008A29～A30,A47,A55～A57,A65～A66,A71,A77,A79,A83,A91,A117,A120A20////2009A32,A78,A164,A168,A178/A152///201013,A16,A18～A19,A21～A22,A24～A25,A27,A31,A33,A40,A48,A51,A57～A58,A65,A71,A85,A98,A102,A113,A127～A128,A158,A162～A163,A180～A182,A186/////2011A1,A11,A14～A15,A23～A24,A26,A30,A34,A37,A43～A44,A46,A63,A65,A71,A89,A95,A100,A104,A109,A111,A114,A139,A141,A146,A155-A157,A159,A160,A165,A167,A169～A170,A179,A183A17,A23,A28,A35,A42,A80,A97,A109,A142,A171,A173//A147～A148,A151/2012A4～A7,A36,A39,A51,A55,A63～A65,A67～A69,A71,A75-A76,A82,A85,A87-A88,A91,A100,A106,A116,A119,A123,A129,A135,A153,A184～A185,A187～A190A3A71,A134/A161/2013A2,A38,A55～A56,A64,A66～A67,A72,A84,A86～A87,A90,A93-A94,A107,A110,A115,A118/////2015A12,A49,A53,A55,A59,A61,A70,A101,A103,A107,A133,A138,A144A59,A176///A59～A602016A8～A10,A50,A52～A54,A57,A59,A61～A62,A65～A66,A68,A70～A72,A77,A81,A91～A92,A96,A101～A102,A108～A109,A112,A117,A121～A122,A124,A130,A136～A137,A140,A145A172,A174-A175A99,A108A97～A98//2017A57,A74,A104,A107,A125～A126,A131,A145//A73～A74//

圖4 基因型A71的感染特點(diǎn)Figure 4 Infection characteristics of genotype A71

根據(jù)本研究中菌株間的相似度高低，其他基因簇很可能屬于不同的種類。從多態(tài)性結(jié)果分析，AC7基因簇簇是目前北京地區(qū)Pp的主要流行群，其次是基因簇AC8，根據(jù)最新的細(xì)菌分類，本地區(qū)感染較多的應(yīng)為R.heylii，其次是R.pneumotropicus。分離株P(guān)P144和PP295的AFLP多態(tài)性條帶僅有2條，相反PP073和PP152的多態(tài)性條帶有80條，兩對(duì)菌株都與其他菌株差異很大。4株菌的生化鑒定結(jié)果以及16SrDNA測(cè)序結(jié)果均證實(shí)為Pp，卻又不同于R.pneumotropicus或R.heylii?？梢?jiàn)，原有Pp分類中還包含有更多菌株[15]，這些菌株的差異和致病力有待進(jìn)一步確認(rèn)。

圖5 基因簇AC8系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 5 Gene cluster AC8 phylogenetic tree

此前的研究表明Jawetz和Heyl的宿主范圍有所不同，前者只感染小鼠、大鼠，后者感染的范圍更廣，這與本研究的結(jié)果相符。根據(jù)現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，檢出任何一種都將判為Pp陽(yáng)性，既不符合SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)。由于二者之間存在的諸多差異[4]，加上其有限的致病作用[16-17]，分類變更后，是否有必要對(duì)小鼠、大鼠以外的動(dòng)物同時(shí)檢測(cè)兩種細(xì)菌，需要更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支撐。