孫小茗，左曉彬，王春宇，柏兆方, 安麗萍，李瑞生*

(1.北華大學藥學院，吉林 吉林 132013；2. 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心，北京 100039；3. 承德醫(yī)學院 河北 承德 067000；4. 錦州醫(yī)科大學 錦州 121001)

肝病是我國常見的疾病之一。在全世界的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢。各種因素導致的肝損傷在肝病的發(fā)生與發(fā)展中起著重要的作用。急性肝損傷是肝病發(fā)生、發(fā)展甚至到惡化的基本途徑，如果不及時治療，甚至引發(fā)肝硬化、肝癌[1]。對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是臨床上應用頻率較高的解熱鎮(zhèn)痛藥，過量的攝入會導致肝損傷[2]，從而影響細胞的增殖、分化與凋亡[3-5]。

蟛蜞菊內(nèi)酯(wedelolactone)屬于香豆草醚類化合物[6-7]，其主要成分提取于墨旱蓮和蟛蜞菊等植物[6-7]。蟛蜞菊是菊科植物蟛蜞菊的全草，主要分布在我國的海南、廣東、福建以及貴州等地，具有涼血散瘀和清熱解毒的功效，在南美洲地區(qū)也將其用于肝疾病、膿毒性休克以及毒蛇咬傷等疾病[7-9]。實驗已經(jīng)證明了蟛蜞菊內(nèi)酯可以抑制LPS所致的RAW264.7細胞IL-6、TNF-α炎性細胞因子的生成[10]，并對抑制肝纖維化具有較好的保護作用[11]。

在蟛蜞菊內(nèi)酯的實際應用過程中發(fā)現(xiàn)，其在體內(nèi)作用時，受到影響的因素較多，實驗結果與體外實驗存在一定的偏差，因此為了進一步觀察蟛蜞菊內(nèi)酯的保肝活性，本文對其進行了研究。在本次試驗中采用的模型是乙酰氨基酚誘導的急性肝損傷，通過試驗中形態(tài)學觀察、生化指標、ELISA反應等證明蟛蜞菊內(nèi)酯對對乙酰氨基酚誘導的小鼠肝損傷的保護作用，為蟛蜞菊內(nèi)酯臨床應用提供可靠的理論參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康SPF級BALB/c小鼠32只，體質(zhì)量(20.1±1.8)g，雄性，6～8周齡，所有小鼠均采購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2017-0006]。飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心[SYXK(軍)2017-010]，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為4組用于實驗。12 h明暗交替照明，自由飲水進食。動物倫理審批號：LACUC-2017-013，按照實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

蟛蜞菊內(nèi)酯購于成都普菲德生物技術有限公司，批號18032201。APAP購自MCE(HY-66005)。谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(reduced glutathione assay kit,GSH)、谷胱甘肽-過氧化物酶(cellular glutathione peroxidase assay kit,GSH-PX)，試驗中應用的測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。丙二醛(micro malondialdehyde assay kit,MDA)、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。

所用儀器為SynergyH2型全功能微孔板檢測儀，生產(chǎn)廠家為美國Bio-Tek公司；Nikon E200型光學顯微鏡及Mini-6 K微型離心機，生產(chǎn)廠家為杭州奧盛儀器有限公司；PL602-L型電子天平，生產(chǎn)廠家為梅特勒-托利多儀器有限公司；HC-3018R型高速冷凍離心機，生產(chǎn)廠家為安徽中科中佳科學儀器有限公司；KPJ-1 A型生物組織攤片烤片機，生產(chǎn)廠家為天津天利航空有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥物配制

稱取蟛蜞菊內(nèi)酯，加生理鹽水混懸至所需濃度(10 mg/kg；20 mg/kg)；稱取對乙酰氨基酚溶于生理鹽水至所需濃度(200 mg/kg)。

1.3.2 動物分組及處理

接受實驗對象為健康BALB/c小鼠，在其飼養(yǎng)7 d后，將其分為對照組、模型組(APAP)、蟛蜞菊內(nèi)酯低劑量組(10 mg/kg，APAP+Wed)、蟛蜞菊內(nèi)酯高劑量組(20 mg/kg，APAP+Wed),每組8只，各組以灌胃的方式給藥，對照組和模型組給與等量生理鹽水，蟛蜞菊內(nèi)酯低、高劑量組每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d。給藥第6天，模型組與蟛蜞菊內(nèi)酯低、高劑量組小鼠腹腔注射溶解在生理鹽水中的APAP(200 mg/kg)，對照組腹腔注射生理鹽水，造模前12 h禁食不禁水，造模12 h后留取組織及血清樣本，做各項測定用。收集的全血標本在室溫凝結1 h后，4℃離心(3500 r/min，15 min)。

1.3.3 血清學指標檢測

小鼠造模后禁食不禁水12 h，留取血清樣本，靜置1 h，3500 r/min，離心15 min取血清，冷藏4℃?zhèn)溆谩０凑赵噭┖姓f明書的方法測定血清中ALT、AST、IL-6、TNF-α。

1.3.4 氧化應激指標檢測

取凍存的肝組織，制備成10%組織勻漿，離心，取上清液，按照試劑盒說明書的方法檢測肝組織中MDA含量和 GSH、SOD、GSH-PX活性。

1.3.5 肝組織病理學觀察

取相同部位的肝組織固定于中性福爾馬林固定液中，脫水石蠟包埋、切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，TUNEL染色，用于組織切片觀察肝細胞的凋亡情況和肝病例損傷情況。

1.3.6 療效觀察及評價

觀察蟛蜞菊內(nèi)酯對小鼠AST、ALT的影響、對小鼠肝中SOD、MDA、GSH、GSH-PX的影響、對小鼠炎性反應的影響、肝細胞壞死以及肝細胞凋亡情況進行觀察。炎性評價指標：通過小鼠血清IL-6、TNF-α水平進行評價，其水平越高代表其炎性反應越大；肝細胞壞死的評價標準：切片中出現(xiàn)無核肝細胞殘體可評價為肝壞死；肝細胞凋亡的評價標準：當TUNEL染色呈陽性時代表 細胞出現(xiàn)凋亡，其切片特點為細胞核表現(xiàn)為棕褐色，凋亡小體則為較小的棕褐色圓形小體。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 對小鼠ALT、AST的影響

ALT，AST是肝損傷的主要酶標記物，當肝細胞受到損傷時，會導致二者血清濃度急劇升高。由表1可以看出，模型組小鼠血清中的AST和ALT水平與對照組對比明顯較高，經(jīng)統(tǒng)計學計算后顯示(P<0.01)，說明其存在統(tǒng)計學意義；蟛蜞菊內(nèi)酯各劑量組的AST和ALT水平明顯要高于模型組，經(jīng)統(tǒng)計學計算后發(fā)現(xiàn)(P<0.01)，統(tǒng)計學意義明顯，結果顯示蟛蜞菊內(nèi)酯具有較好的保護肝受損的作用。見表1。

2.2 對小鼠肝中SOD、MDA、GSH、GSH-PX的影響各組小鼠SOD、MDA、GSH、GSH-PX活力

模型組的GSH和MDA水平明顯高于對照組，且統(tǒng)計學計算后顯示(P<0.01)，統(tǒng)計學意義明顯；模型組的GSH-PX和SOD水平明顯低于對照組，且統(tǒng)計學計算后顯示(P<0.01)，統(tǒng)計學意義明顯；蟛蜞菊內(nèi)酯各劑量的肝組織MDA和GSH水平明顯低于模型組，且SOD和GSH-PX水平高于模型組，組間數(shù)據(jù)差異均顯示(P<0.01)，具有統(tǒng)計學意義。表2結果顯示蟛蜞菊內(nèi)酯具有一定的抗氧化作用。見表2。

2.3 對小鼠TNF-α、IL-6的影響

模型組的IL-6和TNF-α水平明顯高于對照組，且統(tǒng)計學結果顯示(P<0.01)，存在統(tǒng)計學意義；與模型組比較，蟛蜞菊內(nèi)酯各劑量組明顯降低小鼠血清中TNF-α、IL-6水平(P<0.01)，統(tǒng)計學意義明顯。結果表明，蟛蜞菊內(nèi)酯能夠抑制炎性細胞分泌，減輕炎性反應，阻止損傷加重。見表3。

表1 蟛蜞菊內(nèi)酯對小鼠ALT、AST的影響Table 1 Effect of wedelolactone on the levels of ALT and AST in liver tissues

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

Note. Compared with normal group,##P<0.01. Compared with model group,**P<0.01.

2.4 蟛蜞菊內(nèi)酯對肝損傷小鼠肝病例改變的影響

按照以上實驗方法，小鼠連續(xù)給藥7 d后，各組對小鼠的肝實施組織病理學觀察。結果顯示，正常組小鼠肝小葉和肝細胞結構清晰，肝索呈放射狀排列，且核居中。匯管區(qū)未見炎細胞浸潤。肝損傷模型組可見肝小葉結構破壞，排列紊亂，肝血竇擴張充血中央靜脈附近大面積肝細胞壞死，伴有肝細胞廣泛性水腫和細胞炎性浸潤。蟛蜞菊內(nèi)酯各給藥組肝病變程度較模型組有明顯的改善，肝細胞變性和壞死面積明顯減少，局部仍可見炎細胞浸潤。結果提示，模型成功，蟛蜞菊內(nèi)酯各給藥組對緩解肝組織損傷均有一定的作用。見圖1。

2.5 蟛蜞菊內(nèi)酯對肝損傷小鼠凋亡改變的影響

對照組小鼠肝組織切片中未見到黃色細胞核，與對照組比較，模型組黃色細胞核明顯，大量肝細胞凋亡；與模型組比較，蟛蜞菊內(nèi)酯低劑量組和高劑量組棕褐色細胞核減少，肝細胞凋亡明顯減少，且高劑量組明顯優(yōu)于低劑量組。結果進一步表明，蟛蜞菊內(nèi)酯對APAP造成的肝細胞凋亡具有抑制作用且有一定的差異。見圖2。

表2 蟛蜞菊內(nèi)酯對肝組織中SOD、MDA、GSH、GSH-PX的影響Table 2 Effect of wedelolactone on hepatic levels of SOD, MDA, GSH, and GSH-PX

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

Note. Compared with normal group,##P<0.01. Compared with model group,**P<0.01.

表3 蟛蜞菊內(nèi)酯對血清中TNF-α、IL-6的影響Table 3 Effect of wedelolactone on serum levels of TNF-α and IL-6 in the mice

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

Note. Compared with normal group,##P<0.01. Compared with model group,**P<0.01.

圖1 蟛蜞菊內(nèi)酯對纖維化小鼠肝組織病理學的影響(HE染色)Figure 1 Effect of wedelolactone on liver tissue pathology in the mice with liver fibrosis (HE staining)

圖2 蟛蜞菊內(nèi)酯對纖維化小鼠肝組織肝細胞凋亡的影響(TUNEL)Figure 2 Effect of wedelolactone on apoptosis in hepatocytes in the mice with liver fibrosis

3 討論

肝是人體的重要臟器之一，具有解除毒物和藥物的作用，同時也容易受到有害因素的影響，造成肝損傷。發(fā)生肝損傷之后，可通過的一定的方法進行恢復，例如在肝損傷早期，通過及時服用治療藥物可恢復肝細胞的正常功能，但是如果未能及時進行治療，那么損傷的肝細胞則無法恢復至正常，并且會發(fā)展為肝硬化、肝纖維化甚至是肝癌。所以在肝損傷的治療中，能夠明確其發(fā)病機制以及藥物治療的作用，對肝病的治療的具有重要意義。本研究通過建立對乙酰氨基酚誘導的小鼠急性肝損傷模型，研究蟛蜞菊內(nèi)酯對對乙酰氨基酚小鼠的保護作用。

APAP誘導的急性肝損傷動物模型，其具有良好的穩(wěn)定性，并且容易復制，造模時間短，因此其是抗肝纖維化和篩選保肝藥物的較常用的動物模型[13-17]。APAP是應用最為廣泛的非甾體類解熱鎮(zhèn)痛藥，因此對乙酰氨基酚所導致的肝毒性已經(jīng)成為了藥物性肝損傷的主要原因[13-19]。APAP在體內(nèi)的代謝方式主要是通過葡萄糖的硫酸化和醛酸化作用生成無毒的代謝物排出體外[13-20]。一小部分APAP是在細胞色素P450酶的作用下產(chǎn)生NAPQI，NAPQI是毒性中間體，其在肝內(nèi)可以和GSH結合，達到解毒的效果[13-21]。但是當臨床大劑量應用對乙酰氨基酚后，硫酸化通路和葡萄糖醛酸化的通路均達到飽和狀態(tài)，對應的對乙酰氨基酚就會通過細胞色素P450酶轉化成NAPQI，再次過程中會迅速的消耗肝細胞內(nèi)的GSH[13-22]，當GSH被耗盡之后，NAPQI就會與肝細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)結合，最后造成肝細胞的氧化損傷[13-23]。

在肝功能的評估中，常用的評價指標為AST和ALT，當肝細胞受損或者病變后，其細胞膜的通透性就會增加，導致AST和ALT的指標上升[24]。在本研究中模型組的ALT水平和和AST水平上升程度比較明顯，并且經(jīng)過組織學研究后發(fā)現(xiàn)，肝組織結構已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的損壞，此研究結果表明，乙酰氨基酚誘導小鼠急性肝損傷模型復制成功。各劑量給藥組均能顯著降低ALT、AST，同時對乙酰氨基酚對于肝組織造成的損傷已經(jīng)得到了一定程度的控制。結果顯示，蟛蜞菊內(nèi)酯可有效的預防并控制過量對乙酰氨基酚對肝組織造成的損傷，其對于肝細胞具有一定的保護作用。

MDA作為評價組織氧化損傷程度的生物標志物[25]，其水平的上升代表了組織氧化防御系統(tǒng)出現(xiàn)了損壞，同時也代表了組織氧化損傷出現(xiàn)了加強。在機體的抗氧化系統(tǒng)中，SOD是比較關鍵的酶，當其活性降低時，體內(nèi)自由基的含量就會上升，導致脂質(zhì)過氧化，細胞出現(xiàn)損傷[27]。在本次調(diào)查中顯示，當給予小白鼠乙酰氨基酚后，其肝組織中的MDA水平出現(xiàn)了明顯的上升，而SOD的活性則明顯降低，這說明乙酰氨基酚已經(jīng)對小白鼠的抗氧化防御系統(tǒng)造成了破壞，而肝組織也出現(xiàn)了明顯的氧化損傷。

檢測GSH和GSH-PX活性的高低，可以間接反映機體對氧自由基的清除能力。結果表明與模型組相比，蟛蜞菊內(nèi)酯各給藥組與GSH和GSH-PX活性均有顯著性差異，說明蟛蜞菊內(nèi)酯能提高機體對氧自由基的清除能力，從而減輕氧化應激所致的肝損傷的嚴重程度。

對乙酰氨基酚誘導的肝細胞壞死，可激活固有免疫細胞，而固有免疫細胞釋放的炎性介質(zhì)，如炎性因子，氧自由基等，參與肝損傷的進展。庫普弗細胞定位于肝的具有噬菌作用的巨噬細胞，具有免疫調(diào)節(jié)作用。有文獻表明，對乙酰氨基酚誘導的情況下，庫普弗細胞激活產(chǎn)生的TNF-α表達量升高[28-29]，Masubuchi等[30]研究發(fā)現(xiàn)，IL-6基因敲除的小鼠肝細胞內(nèi)的熱休克蛋白缺乏，導致機體對對乙酰氨基酚肝毒性更加敏感。本實驗結果表明小鼠血清中TNF-α水平明顯升高，經(jīng)過蟛蜞菊內(nèi)酯治療后，小鼠血清中TNF-α、IL-6明顯降低。說明蟛蜞菊內(nèi)酯可以抑制炎性細胞分泌TNF-α、IL-6，減輕炎性反應，阻止肝損傷加重。HE和TUNEL染色切片顯示，與模型組比較，蟛蜞菊內(nèi)酯組肝組織形態(tài)改善明顯，說明蟛蜞菊內(nèi)酯具有減輕炎性細胞浸潤，抑制細胞凋亡的作用。

綜上所述，蟛蜞菊內(nèi)酯可以抑制對乙酰氨基酚對肝的損傷，提示蟛蜞菊內(nèi)酯可能是一種具有明顯保肝作用，極具開發(fā)價值的候選藥物，作用可能與抑制對乙酰氨基酚對肝的氧化損傷有關。也為進一步探究機制提供了依據(jù)。