弭小藝,岳 清,陳俊良,曹福源,張 偉

(1.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，河北 唐山063210；2.華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，河北 唐山063210； 3.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山063210)

腎缺血/再灌注(renal ischemia/reperfusion, RIR)是指由于腎血液供給不足而后恢復(fù)血液，灌注時(shí)其功能無法恢復(fù)正常，甚至加重其功能障礙以及結(jié)構(gòu)損傷的一種病理狀態(tài)[1-2]，除了對(duì)腎本身造成損傷外，還可以對(duì)心、肺、肝等遠(yuǎn)隔器官造成損傷。其中心臟作為機(jī)體重要的生命器官，需氧量大，能量代謝過程復(fù)雜。腎在RIR過程中所產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物和炎性介質(zhì)，極易進(jìn)入血液循環(huán)，從而影響作為遠(yuǎn)隔器官心臟的代謝與功能。近年來有關(guān)活性氧損傷、鈣超載、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等途徑在RIR中的作用受到廣泛關(guān)注,但有關(guān)上述途徑在RIR所致遠(yuǎn)位器官損傷的確切機(jī)制一直存在爭(zhēng)議。還有研究表明，維生素E可應(yīng)用于預(yù)防心腦血管疾病、腫瘤、糖尿病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[3]，其中VE預(yù)防心血管疾病的抗病機(jī)制可能與其抗氧化、抗炎、提高機(jī)體免疫力作用有關(guān)[4-5]，但有關(guān)維生素E對(duì)腎缺血再灌注后心肌損傷的影響尚未見報(bào)道。因此本研究選擇心肌作為RIR的遠(yuǎn)隔器官，在RIR模型的基礎(chǔ)上灌胃給予一定量VE，進(jìn)而觀察外源性VE對(duì)RIR后心肌的影響，以期為腎缺血再灌注致心肌損傷的研究及防治提供新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性SPF級(jí)56～62日齡SD雄性大鼠30只(由華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心技術(shù)有限公司[SCXK(京)2012-0001]，實(shí)驗(yàn)在唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行[SYXK(冀)2015-0038]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過，編號(hào):2017080)。將大鼠隨機(jī)分成3組(每組10只),喂養(yǎng)28 d：①對(duì)照(Control)組：常規(guī)飼養(yǎng)；②RIR組：常規(guī)飼養(yǎng)；③VE+RIR組：于手術(shù)前連續(xù)灌胃給藥飼養(yǎng)4周，VE的給藥劑量為每日500 mg/kg。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型復(fù)制

取相應(yīng)組別的SD大鼠腹腔注射3%的戊巴比妥鈉溶液(100 mg/kg)進(jìn)行麻醉，然后開腹，暴露并夾閉雙側(cè)腎動(dòng)、靜脈45 min后恢復(fù)血流，復(fù)制腎缺血再灌注損傷模型。操作中觀察腎由紅變白再變紅，則認(rèn)為腎經(jīng)歷缺血再灌注損傷，即造模成功。模型復(fù)制完畢后再逐層縫合腹膜、腹壁肌肉和皮膚。對(duì)照組除不夾閉雙側(cè)腎動(dòng)、靜脈外，其余手術(shù)操作同模型復(fù)制組。給藥組于手術(shù)前灌胃給藥飼養(yǎng)28 d，VE的給藥劑量為每日500 mg/kg，其余操作處理同模型復(fù)制組。

1.2.2 樣品采集及檢測(cè)

經(jīng)頸動(dòng)脈行左心室插管于再灌注結(jié)束前15 min, 采用BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司研制開發(fā))檢測(cè)再灌注后24 h時(shí)各組動(dòng)物的心功能指標(biāo)：平均動(dòng)脈壓(MAP)、左心室收縮壓(LVSP)、左室內(nèi)壓上升及下降最大速率(±dp /dtmax)，然后進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血并開胸留取心臟組織標(biāo)本。將取好的心尖組織用福爾馬林(體積分?jǐn)?shù)為0.1)固定，進(jìn)行HE染色，最后光鏡下觀察心肌的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定及試劑來源

(一)心肌組織生化指標(biāo)測(cè)定

取0.5 g心肌組織用冷生理鹽水制成10%勻漿，采用比色法測(cè)定心肌組織中丙二醛(MDA)的含量及過氧化物酶(MPO)、黃嘌呤氧化酶(XO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性, 結(jié)果分別以μmol/g、OD/(min·g)、U/g、U/mg表示。以上試劑盒均購(gòu)自南京建成生物制品公司，全部操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

(二)血漿生化指標(biāo)測(cè)定

采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血漿中肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)，結(jié)果以103U/L表示。生化試劑盒均購(gòu)自南京建成生物制品公司，全部操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

(三)心肌組織NO含量測(cè)定

采用硝酸還原酶法測(cè)定心肌組織一氧化氮(NO)的含量，通過顯色深淺測(cè)定其濃度大小，結(jié)果以μmol/L表示。試劑盒購(gòu)自南京建成生物制品公司，全部操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

(四)心肌組織eNOS合酶免疫組化染色

對(duì)厚度為4 μm的心肌組織石蠟切片進(jìn)行SABC法免疫組織化學(xué)染色，具體步驟如下：①將石蠟切片用蒸餾水和PBS 各沖洗 5 min；② 3%的 H2O2室溫孵育 10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶；③PBS沖洗5 min后10%的正常山羊血清37℃封閉30 min；④滴加 1∶50 稀釋的一抗(購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司)，4℃過夜；⑤PBS 沖洗 5 min×3 次；⑥滴加1∶100 稀釋的二抗(購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司)，37℃孵育 30 min；⑦PBS 沖洗 5 min×3 次；⑧辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素(SP)染色(染色按SP試劑盒說明書操作)，37℃孵育 30 min；⑨PBS 沖洗 5 min×3 次；⑩二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色；蒸餾水沖洗，終止顯色；蘇木素復(fù)染；梯度脫水，二甲苯透明，甘油封片，鏡檢。eNOS 合酶若結(jié)果為陽(yáng)性反應(yīng)，則細(xì)胞胞漿呈棕黃色；若結(jié)果為陰性反應(yīng)，則細(xì)胞胞漿不著色，結(jié)果以圖片形式呈現(xiàn)，圖片截取自400倍高倍鏡視野。

(五)心肌組織HE染色

將各組大鼠心臟石蠟橫斷面連續(xù)切 5～6 片(5 μm)，切片常規(guī)脫蠟至水，HE染色步驟如下：①蘇木素染色 15 min；②流水稍洗去蘇木素染液；③ 0.5%鹽酸乙醇分化 10 s；④自來水浸洗 5 min(藍(lán)化)；⑤伊紅染色 5 s，蒸餾水稍洗；⑥依次 70%，85%，95%和100%酒精脫水；⑦二甲苯透明，中性樹膠封片；⑧光鏡下觀察心肌病理學(xué)變化。蘇木素、伊紅購(gòu)自羅基(北京)生物技術(shù)有限公司，結(jié)果以圖片形式呈現(xiàn)，圖片截取自200倍高倍鏡視野。

(六)大鼠心臟左室功能檢測(cè)

經(jīng)頸動(dòng)脈行左心室插管于再灌注結(jié)束前15 min,采用BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司研制開發(fā))檢測(cè)再灌注后24 h時(shí)各組動(dòng)物的心功能指標(biāo)：平均動(dòng)脈壓(MAP)、左心室收縮壓(LVSP)、左室內(nèi)壓上升及下降最大速率(±dp /dtmax)。前兩者的結(jié)果以kPa表示，后兩者的結(jié)果以kPa/s表示。

(七)Western blot法檢測(cè)心肌中p47Phox蛋白的表達(dá)

取100 mg液氮凍存的各組大鼠心肌組織，各加入組織蛋白裂解液0.5 mL，充分研磨,取出勻漿液，4℃離心15 000 r/min，20 min。取所得上清100 μg蛋白樣品，于100℃煮沸3 min。具體操作步驟如下：灌膠后于100℃煮沸3 min后上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳分離蛋白，300 mA轉(zhuǎn)膜2 h將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，1%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h，滴加一抗，4℃過夜，然后滴加二抗，室溫1 h，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光試劑放射自顯影，X射線膠片曝光，拍照。以Quantity one 對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，最終結(jié)果以目的條帶和β-actin條帶積分灰度值比值得出，以圖片形式呈現(xiàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 血漿CK、CK-MB 和NO含量

CK與CK-MB二者在任意兩組間均呈同向變化,再灌注后升高,加入VE后有所回降。血漿NO含量在再灌注后升高，尤以VE+RIR組與RIR組相比升高的更明顯。即與對(duì)照組相比，RIR組血漿中CK、CK-MB和NO含量升高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與RIR組相比，VE + RIR組血漿中CK、CK-MB水平降低而NO含量升高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

2.2 心肌組織MDA、MPO、XO和SOD變化

與對(duì)照組相比，RIR組心肌組織MDA含量升高，MPO和XO活性上升而SOD活性下降且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與RIR組相比，VE+RIR組心肌組織MDA含量降低，MPO和XO活性降低而SOD活性升高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(MDAP<0.01，MPO,XO,SODP<0.05)，見表2。

2.3 各組動(dòng)物左室功能變化

與對(duì)照組比較，MAP、LVSP、dP /dtmax和-dP/dtmax在RIR組降低且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與RIR組相比，MAP、LVSP在VE + RIR組均升高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)；dP/dtmax、-dP/dtmax在VE+RIR組也均升高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，見表3。

2.4 心肌組織形態(tài)學(xué)變化

對(duì)照組心肌細(xì)胞大小、形態(tài)均正常。RIR后可見心肌組織水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、少數(shù)心肌細(xì)胞變性等。而VE+RIR組心肌組織的水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變均較RIR組有所減輕，見圖1。

2.5 心肌組織eNOS免疫組織化學(xué)

對(duì)照組 e NOS 無明顯表達(dá)，RIR組 e NOS 在心肌細(xì)胞胞漿有少量表達(dá)，VE+RIR組織 e NOS 較RIR組表達(dá)增強(qiáng)，見圖2。

2.6 心肌細(xì)胞P47phox蛋白表達(dá)

Control組 P47phox少量表達(dá)，RIR 組P47phox 在心肌細(xì)胞胞漿有大量表達(dá)，VE+RIR 組織 P47phox較 RIR組表達(dá)減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

表1 各組血漿中CK、CK-MB和NO含量變化Table 1 Plasma levels of CK, CK-MB, and NO in the three groups

注：與對(duì)照組相比，△△P<0.01，與RIR組相比，**P<0.01。

Note. Compared with the control group，△△P<0.01. Compared with the RIR group，**P<0.01.

表2 各組心肌組織中MDA，MPO，XO和SOD的變化Table 2 MDA, MPO, XO, and SOD contents in myocardium of the three groups

注：與對(duì)照組相比，△△P<0.01，與RIR組相比，*P<0.05,**P<0.01。

Note. Compared with the control group,△△P<0.01. Compared with the RIR group,*P<0.05,**P<0.01.

表3 各組動(dòng)物左室功能變化Table 3 Left ventricular functions of the rats in three groups

注：與對(duì)照組相比，△△P<0.01，與RIR組相比，*P<0.05,**P<0.01。

Note. Compared with the control group,△△P<0.01. Compared with the RIR group,*P<0.05,**P<0.01.

注：A：對(duì)照組；B：RIR組；C：VE+RIR組。圖1 心肌組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色)Note. A, Control group. B, RIR group. C, VE+RIR group.Figure 1 Histological changes of the rat myocardium among the three groups (HE staining)

注：A：對(duì)照組；B：RIR組；C：VE+RIR組。圖2 VE對(duì)RIR大鼠eNOS表達(dá)的影響Note. A, Control group. B, RIR group. C, VE+RIR group.Figure 2 Effect of VE on eNOS expression in myocardial tissues of RIR rats (×400)

注：與對(duì)照組相比，##P<0.01，與RIR組相比, **P<0.01。圖3 Western blotting檢測(cè)P47phox在心肌組織中的表達(dá)Note. Compared with the control group,##P<0.01. Compared with the RIR group, ** P<0.01.Figure 3 Expression of P47phox in the rat myocardial tissue detected by western blotting

3 討論

腎缺血/再灌注(renal ischemia/reperfusion, RIR)是由于腎血液供給不足而后恢復(fù)血液，灌注時(shí)其功能無法恢復(fù)正常，甚至加重其功能障礙以及結(jié)構(gòu)損傷的一種病理狀態(tài)[1-2]，其發(fā)生機(jī)制可能與鈣超載[6-7]、炎性反應(yīng)[8-9]、活性氧損傷[10]和細(xì)胞凋亡[11]等有關(guān)，腎移植、失血或中毒后的微循環(huán)再通和腎盂積水等為臨床上引起RIR的常見原因。此外，RIR除了對(duì)腎本身造成損傷外，還可以對(duì)心、肺、肝等遠(yuǎn)隔器官造成損傷，嚴(yán)重影響著疾病的轉(zhuǎn)歸及預(yù)后[12]。

維生素E(vitamin E, VE)是一種脂溶性維生素，以苯并二氫吡喃為主要結(jié)構(gòu)，在該環(huán)的6位酚羥基上的活潑氫釋放可以與自由基結(jié)合形成穩(wěn)定的化合物，阻斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而阻斷氧化反應(yīng)。VE可與超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)一起構(gòu)成體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，保護(hù)細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)的核酸免受自由基的攻擊[13]。近年來，人類將維生素E應(yīng)用于預(yù)防心腦血管疾病、腫瘤、糖尿病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[3]，其中VE預(yù)防心血管疾病的抗病機(jī)制可能與其抗氧化、抗炎、提高機(jī)體免疫力作用有關(guān)[4-5]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇心肌作為RIR損傷的遠(yuǎn)隔器官，探討RIR后對(duì)心肌的損傷機(jī)制以及VE對(duì)RIR后心肌損傷的治療作用，為RIR后致心肌損傷的防治提供理論依據(jù)。

心臟作為機(jī)體重要的生命器官，需氧量大，能量代謝過程復(fù)雜。腎在RIR過程中產(chǎn)生的氧自由基、脂質(zhì)過氧化物(如MDA等毒性產(chǎn)物)進(jìn)入血液循環(huán)，會(huì)引起遠(yuǎn)隔器官心臟的氧化應(yīng)激狀態(tài)；同時(shí)也會(huì)激活中性粒細(xì)胞釋放MPO、XO和前炎癥因子，從而影響作為遠(yuǎn)隔器官的心臟的代謝與功能。RIR后心肌組織受到氧化應(yīng)激損傷從而細(xì)胞膜通透性增加，大量CK和CK-MB從心肌細(xì)胞中漏出，使其在血漿中含量同步升高[14]，因此可作為心肌受損的特異性標(biāo)志。在本研究中CK與CK-MB二者在任意兩組間均呈同向變化, 與對(duì)照組相比，RIR組血漿中CK與CK-MB含量均升高；與RIR組相比，VE+RIR組血漿中CK與CK-MB含量均降低且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果與Feng等[15]在2018年的研究結(jié)果一致。這說明在RIR后心肌細(xì)胞受損，CK和CK-MB從心肌細(xì)胞中漏出增多，VE通過減少氧自由基等毒性物質(zhì)對(duì)心肌細(xì)胞膜的損害，減少CK和CK-MB從心肌細(xì)胞中漏出，從而起到RIR對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用，而具體保護(hù)機(jī)制還有待更進(jìn)一步研究。

本研究RIR后心肌組織中MDA含量增多，MPO和XO活性升高而SOD活性下降且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果與Wang等[16]在2017年的研究結(jié)果一致，說明在RIR后心肌組織受到氧化應(yīng)激和炎癥損傷，大量釋放MDA、MPO和XO等毒性物質(zhì)；而SOD具有抗炎、清除體內(nèi)過量氧自由基的功能，所以在心肌組織受到氧化應(yīng)激損傷時(shí)，SOD的含量下降。VE給藥干預(yù)后心肌組織中MDA、MPO和XO水平降低而SOD活性升高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明在VE給藥干預(yù)后，大鼠RIR后心肌也會(huì)受到氧化應(yīng)激和炎癥損傷，但是損傷程度減輕，所以MDA、MPO和XO含量下降，SOD的含量升高。此結(jié)果提示氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)可以使RIR后心肌組織受到損傷，同時(shí)VE具有減輕這些損傷的作用，從而起到保護(hù)作用。

為較客觀測(cè)定VE對(duì)RIR致心肌損傷狀態(tài)下血流動(dòng)力學(xué)的影響，對(duì)心功能做出正確評(píng)價(jià)，本研究對(duì)MAP、LVSP、dP /dtmax和-dP/dtmax進(jìn)行測(cè)定。LVSP和dP /dtmax反映心肌收縮強(qiáng)度，-dP/dtmax反映心肌舒張功能；當(dāng)心率、前負(fù)荷不變或升高時(shí)，dP /dtmax和LVSP不變或降低，表示心室肌收縮力減小，心收縮功能異常；當(dāng)MAP降低時(shí)，-dP/dtmax降低，表示心室肌舒張力減小，心舒張功能異常。本研究中RIR后大鼠的MAP、LVSP、dP /dtmax和-dP/dtmax數(shù)值均降低且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此結(jié)果與劉雨娟等[17]在2015年的研究結(jié)果一致;與RIR組相比，VE+RIR組的MAP、LVSP、dP/dtmax和-dP/dtmax數(shù)值均升高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明在RIR后心功能受損，VE對(duì)RIR致心功能損傷具有保護(hù)作用，而具體保護(hù)機(jī)制還有待深入研究。

已有研究發(fā)現(xiàn)eNOS及內(nèi)源性NO對(duì)線粒體具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是NO通過激活鳥苷酸環(huán)化酶循環(huán)-環(huán)鳥甘酸通路，進(jìn)而激活和轉(zhuǎn)錄蛋白激酶C、線粒體ATP敏感性鉀通道，保護(hù)線粒體，降低氧化應(yīng)激對(duì)組織細(xì)胞的損傷[18-19]，還可以舒張冠脈、提高缺血心肌的收縮能力，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、減少自由基等。eNOS主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，催化細(xì)胞分泌的NO作用于血管平滑肌、中性粒細(xì)胞等，有保護(hù)心肌的作用[20]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，RIR組心肌組織中NO含量升高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與RIR組相比，VE + RIR組心肌組織中NO含量升高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組eNOS無明顯表達(dá)，RIR組eNOS在心肌細(xì)胞胞漿有少量表達(dá)，該結(jié)果與Song等[21]在2014年的研究結(jié)果一致，而VE+ RIR組織 eNOS 較RIR組表達(dá)增強(qiáng)。這說明RIR引起心肌組織內(nèi)血管內(nèi)皮的損傷，影響心肌收舒機(jī)能，促使心肌細(xì)胞大量合成eNOS和NO來緩解RIR產(chǎn)生的氧自由基等毒性物質(zhì)對(duì)心肌組織的損傷作用，所以RIR后，心肌組織中的NO含量升高，eNOS在心肌細(xì)胞胞漿中有少量表達(dá)。VE給藥干預(yù)后，促進(jìn)心肌細(xì)胞更多地合成用來緩解RIR對(duì)心肌損傷作用的eNOS和NO，所以其心肌組織中的NO含量更加升高，eNOS在心肌細(xì)胞胞漿中表達(dá)增強(qiáng)。雖然eNOS和NO具有緩解RIR致心肌損傷的作用，但其緩解作用不足以抵消其他氧化應(yīng)激產(chǎn)物對(duì)心肌的損傷作用，所以心肌組織整體上還是呈現(xiàn)損傷狀態(tài)。因此證明VE具有減輕RIR對(duì)心肌的損傷作用，其機(jī)制可能是VE通過增加心肌組織內(nèi)NO的含量和心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)e NOS的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，活性氧的生成需要多種酶參與，如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)、線粒體呼吸鏈復(fù)合酶和黃嘌呤氧化酶等。其中，作為體內(nèi)生成活性氧重要來源的NADPH氧化酶的活化過程需要P47Phox來調(diào)節(jié)，即P47Phox在NADPH氧化酶的激活過程中起著至關(guān)重要的作用，促進(jìn)活性氧大量產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組 P47phox少量表達(dá)，RIR組P47phox在心肌細(xì)胞胞漿有大量表達(dá)，VE+RIR組織P47phox較RIR組表達(dá)減少且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與荊嬌等[22]在2015年的研究結(jié)果一致。由于RIR后心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)大量表達(dá)P47phox，進(jìn)而大量釋放活性氧等毒性物質(zhì)，造成心肌氧化應(yīng)激損傷。VE給藥干預(yù)后，RIR后心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)P47phox相對(duì)減少，進(jìn)而減少活性氧等毒性物質(zhì)的釋放。這提示，VE具有減輕RIR致心肌損傷的作用，其機(jī)制可能是VE通過減少心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)P47phox的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

為更加直觀地反映VE對(duì)RIR致心肌損傷的保護(hù)作用，本研究中進(jìn)行光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化，光鏡下顯示對(duì)照組心肌組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)均正常；RIR組心肌組織內(nèi)可見水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，少數(shù)心肌細(xì)胞變性等；而VE+RIR組與I/R組相比，心肌組織水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變均有所減輕。這提示在RIR后心肌組織受損，VE對(duì)RIR致心肌組織損傷具有保護(hù)作用。

綜上所述，RIR造成遠(yuǎn)隔器官心肌組織損傷的機(jī)制尚不明確，推測(cè)其可能機(jī)制為來源于RIR形成的氧自由基、炎性因子等毒性物質(zhì)大量進(jìn)入血液循環(huán)，通過氧化應(yīng)激、炎癥損傷等途徑導(dǎo)致心肌損傷和心功能障礙。VE通過抗炎、抗氧化、升高NO含量、增加eNOS的表達(dá)和減少P47phox表達(dá)等途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)RIR后心肌損傷的保護(hù)作用。