白曉紅，盛小丹，劉 芳，楊鶇祥*

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，沈陽110032； 2. 遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽110847)

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應性為特征的異質性疾病，主要以反復發(fā)作的喘息、咳嗽、氣促、胸悶為臨床表現，經常會在夜間和/或凌晨發(fā)作或加劇，呼吸道癥狀的具體表現形式和嚴重程度具有隨時間而變化的特點，并常伴有可變的呼氣氣流受限[1]。根據2010年流行病學調查顯示，我國兒童哮喘平均累積患病率為3.02%[2]。其中年齡在學齡期前后的兒童的患病率升高最為明顯[3]。對于兒童哮喘的治療要盡早采取措施。遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院應用“伏九貼膏”治療兒童哮喘已有悠久的歷史，并取得了較好的臨床效果[4-5]。但其作用機制尚不明確，所以本實驗目的即探討“伏九貼膏”治療哮喘的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級6～8周齡BALB/c小鼠50只，雌雄各半，體重18～20 g，均購于北京斯貝福實驗動物有限公司[SCXK(京)2016-0002]，動物飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學動物中心[SYXK(遼)2013-0009]，實驗動物的使用過程中嚴格遵守3R原則，并得到了遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會的批準[倫理審批號：21000092017067]。

1.1.2 藥物制備

“伏九貼膏”選用白芥子、延胡索、甘遂、桑白皮、酒大黃、細辛，按照一定比例共研細末，鮮姜汁調成藥餅， 置于4 cm × 4 cm大小的紗布上，中間加麝香制成。其中高劑量含生藥量0.36 g/g，低劑量含生藥量0.09 g/g。以上藥物均由遼寧中醫(yī)藥大學分子藥理實驗室提供。

1.2 主要試劑與儀器

地塞米松磷酸鈉注射液, 購自國藥集團寄生制藥有限公司, 國藥準字 H41020036, 批號1801226；卵清蛋白(OVA，A5253-500G)購自Sigma；氫氧化鋁干粉(S30353-500 g)購自源葉生物。小鼠IGE ELISA試劑盒(貨號：m1037602)購自酶聯生物；小鼠卵清蛋白特異性IGE酶聯免疫分析試劑盒(貨號:F2291-A)購自凡科維；小鼠IL-4 ELISA試劑盒(貨號：m1002038)購自酶聯生物；小鼠IFN-γ ELISA試劑盒(貨號：m002277)購自酶聯生物；一抗Rabbit Anti-NGF(貨號：ABP51959)購自Abbkine；一抗Rabbit Anti-TRKA(貨號：ABP55429)購自Abbkine；中杉金橋PV-6000 通用二步法檢測試劑盒；DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

奧華402AI型超聲霧化儀(廣東魚躍)；離心機Eppendorf Centrifuge 5804 R；顯微鏡Olympus CX-41；數碼照相機SmartV350D；Hestion ATP 700(ST)電腦全自動脫水機；酶標儀(美國BioTek Instruments, Inc，型號Epoch)；自制塑料霧化箱(50×30 ×30)cm。

1.3 實驗方法

1.3.1 卵清蛋白(OVA)誘導哮喘小鼠模型

根據對前人造模方法的研究和修改，建立經由卵清蛋白(OVA)誘導的哮喘小鼠模型。除正常對照組以外，其他各組小鼠分別在第0、7、14 天給予腹腔注射致敏液每只0.2 mL，致敏液成分為10 μg OVA和2 mg氫氧化鋁粉末；自21 d到28 d，給予5%OVA混懸液霧化吸入，每日一次，每次30 min，同時觀察小鼠呼吸運動情況，看是否有呼吸急促、點頭呼吸、活動減少等情況。正常對照組給予同體積的生理鹽水腹腔注射和霧化吸入[6]。

1.3.2 分組給藥治療

從第21 天開始，霧化激發(fā)哮喘的同時，C組給予地塞米松注射液腹腔注射，每日一次，每只2 mg，D、E組分別給予高低濃度藥物貼敷治療，每日一次，每次4 h。A、B組不做給藥處理。

1.3.3 取材

在最后一次霧化吸入激發(fā)后24 h，收集全血，靜止2 h后，4℃，3000 r/min，離心10 min，取血清，-80℃低溫保存。取小鼠左肺，浸泡于4%甲醛溶液中，常溫保存。取小鼠右肺，生理鹽水沖洗掉血液后用濾紙吸干，放置-80℃低溫保存。

1.3.4 血清中總IGE、OVA特異性IGE、IFN-γ、IL-4的測定

血清于-80℃冰箱中取出，室溫融化。ELISA試劑盒于4℃冰箱中取出，室溫平衡20 min，按照說明書操作步驟逐個加樣，測定。

1.3.5 肺組織的病理改變(HE染色及Masson染色)

取甲醛固定24 h后的小鼠左肺，修剪后，流水沖洗10 min，石蠟包埋，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，切片，烘片機38℃烘片0.5 h，溫箱68℃烘片2 h，二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水，蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察炎性細胞浸潤情況。Masson染色按照試劑盒說明書步驟操作。

1.3.6 免疫組化檢測肺組織中NGF，TrKA蛋白的表達

石蠟包埋后切片，厚度0.6 μm，烘片機46℃烘片2 h，溫箱70℃烤片3 h，余溫過夜后二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，抗原修復后，加內源性過氧化物酶16 min，洗凈后加10%胎牛血清0.5 h，一抗4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5 min，二抗孵育20 min，PBS沖洗3次，每次5 min，加入新鮮配置的DAB顯色劑，顯色3 min后，蒸餾水沖洗終止顯色，自來水中浸泡10 min，蘇木素復染2 min，鹽酸酒精分化1 s，自來水浸泡10 min，梯度酒精、二甲苯脫水透明，中性樹膠封片后光鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 病理改變(HE染色和Masson染色)

正常對照組肺組織內各級支氣管、肺泡壁、粘膜上皮形態(tài)較完整，偶見個別炎性細胞浸潤和膠原沉積；哮喘模型組可見支氣管粘膜及肺泡周圍有較多炎性細胞浸潤和藍色膠原纖維形成。部分肺泡破壞、融合，氣道上皮組織多處斷裂；地塞米松組、伏九貼高劑量組及伏九貼低劑量組較模型組相比，肺組織炎性細胞浸潤程度以及膠原沉積數量均有所減輕，其中伏九貼高劑量組優(yōu)于伏九貼低劑量組，地塞米松組與伏九貼高劑量之間無明顯差異。(見圖1-2)

注：A：正常組小鼠肺組織；B：哮喘模型組小鼠肺組織；C：地塞米松組小鼠肺組織；D：伏九貼高劑量組小鼠肺組織；E：伏九貼低劑量組小鼠肺組織。圖1 小鼠肺組織的病理改變(HE染色)Note. Lung tissue of mice in (A) control group, (B) model group, (C) dexamethasone group, (D) high-dose Fujiu plaster group, and (E) low-dose Fujiu plaster group.Figure 1 Pathological changes of the mouse lung tissues. HE staining

2.2 ELISA檢測血清中總IGE、OVA特異性IGE、IFN-γ、IL-4細胞因子含量

與正常對照組相比較，哮喘模型組小鼠血清中總IGE、OVA特異性IGE、IL-4濃度明顯升高，IFN-γ濃度明顯降低，均有顯著差異(P<0.05)。與模型組相比較，地塞米松組和伏九貼高劑量組小鼠血清中總IGE、OVA特異性IGE、IL-4濃度降低，IFN-γ濃度升高，均有顯著差異(P<0.05)。與模型組比，伏九貼低劑量組小鼠血清中的IL-4濃度降低，差異顯著(P<0.05)，但總IGE、OVA特異性IGE和IFN-γ濃度改變不明顯，差異無顯著意義(P>0.05)。(見表1)

2.3 免疫組化法檢測NGF和TrKA在肺組織內的表達

如圖3所示，胞漿內的棕黃色顆粒為神經生長因子(NGF)的陽性表達，圖4中，胞漿內棕黃色顆粒為TrKA蛋白的陽性表達。與正常對照組相比，模型組細胞數量以及胞漿中NGF和TrKA表達明顯增多；與模型組相比，地塞米松組和伏九貼高劑量組細胞數量明顯減少，而且NGF和TrKA蛋白的表達減少的也很明顯；伏九貼低劑量組與模型組相比，NGF和TrKA蛋白的表達棕黃色顆粒有所減少，但差異不明顯。(見表2)

注：與正常組比，*P<0.05;與模型組相比，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the model group,△P<0.05.

注：A:正常對照組；B:模型組；C:地塞米松組；D:伏九貼高劑量組；E:伏九貼低劑量組。圖3 各組肺組織的病理改變Note. A， Normal control group. B， Asthma model group. C， Dexamethasone group. D， Fujiu plaster high dose group. E， Fujiu plaster low dose group.Figure 3 Histological changes in the lung tissues of the mice. NGF immunohistochemical staining

注：A：正常組；B：模型組；C：地塞米松組；D：伏九貼高劑量組；E：伏九貼低劑量組。圖4 各組小鼠肺組織中TrKA的表達(TrKA免疫組化染色)Note. A. Normal group. B. Model group. C. Dexamethasone group. D. Fujiu plaster high dose group. E. Fujiu plaster low dose group.Figure 4 TrKA expression in the lung tissues of the mice. TrKA immunohistochemical staining.

組別GroupsNGF (μm2) TrKA (μm2) 正常組Normal group模型組Model group地塞米松組Dexamethasone group伏九貼高劑量組Fujiu plaster high dose group伏九貼低劑量組Fujiu plaster low dose group209 882.23±25 401.53507 470.06±63 666.94?279 163.83±56 882.24△261 871.30±43 252.94△416 661.94±216 620.16165 186.90±42 661.72441 977.57±67 111.40?242 579.78±39 613.13△298 163.18±27 995.59△416 999.19±158 971.14

注：與正常組比，*P<0.05;與模型組相比，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the model group,△P<0.05.

3 討論

祖國醫(yī)學認為，哮喘的發(fā)作是由于外感風寒之邪誘發(fā)患者素體伏痰，導致肺失宣肅，痰氣搏結，壅阻氣道，因病之根本屬于本虛標實，故治療原則為發(fā)作期以祛邪為主，緩解期以扶正為主。伏九貼膏中白芥子治皮里膜外、胸隔間之痰涎，甘遂善行逐水濕，元胡活血利肺氣，細辛生姜溫散而宣肺，麝香走竄，開竅通閉，幫助藥物透皮吸收，結合穴位，調暢全身氣機，藥穴同用，祛邪同時扶正固本，長期以來應用于防治支氣管哮喘?，F有的關于穴位貼敷治療哮喘的動物實驗研究顯示，應用白芥子等藥物的穴位貼敷可逆轉卵清蛋白誘導的哮喘小鼠TH1/TH2失衡，從而減輕氣道炎癥反應[7-8]。但關于穴位貼敷是否是通過NGF/TrKA途徑來調節(jié)TH1/TH2失衡的研究，目前未見相關報道。因此，本研究觀察了伏九貼膏穴位貼敷對哮喘小鼠肺組織NGF/TrKA的表達量以及對TH1/TH2失衡的影響，探討其抑制哮喘小鼠肺部炎癥的可能機制。

目前的研究認為，在哮喘發(fā)病機制中TH1/TH2的失衡占有重要地位。其中，TH2型細胞因子分泌增多在哮喘的免疫失衡機制中具有關鍵作用[9]。IL-4作為TH2型細胞因子，可募集多種炎性因子，其中包括嗜酸性粒細胞、肥大細胞等，從而加重炎癥反應。并且通過促進免疫球蛋白的轉換，使IGE 的分泌增多[10]。TH2型細胞因子增多的同時，抑制了TH1型細胞因子的分泌，IFN-γ屬于TH1型細胞因子，可以增強中性粒細胞吞噬能力，促進巨噬細胞吞噬免疫復合物、抗體包被的病原體等[11]。

在本實驗研究中，對比觀察了小鼠生存狀態(tài)；肺組織切片HE染色和Masson染色的病理變化；ELASA分別檢測TH1型細胞因子IFN-γ和TH2型細胞因子IL-4、IGE以及OVA特異性IGE表達水平。結果顯示，卵清蛋白誘導的哮喘小鼠活動明顯減少，呼吸頻率加快，并且呼吸時伴有點頭和喘鳴音，肺組織炎性細胞浸潤明顯，并且細支氣管周圍可見膠原纖維的沉積，血清中IL-4、IGE、OVA特異性IGE表達顯著升高，IFN-γ表達降低，TH1/TH2失衡，說明OVA誘導成功建立小鼠哮喘模型。相比于哮喘模型小鼠，經伏九貼膏干預后，小鼠肺組織炎癥減輕，氣道膠原纖維減少，血清中IL-4、IGE、OVA特異性IGE表達降低，IFN-γ表達升高，說明伏九貼膏通過降低TH2型細胞因子表達水平，升高TH1型細胞因子水平，使TH1/TH2趨于平衡，緩解哮喘相關癥狀。

近年來，關于神經生長因子(NGF)做為介導哮喘免疫源性炎癥的重要物質受到人們的關注。NGF除了可由神經細胞分泌外，還可由非神經細胞(如免疫細胞、組織細胞等)分泌[12]。大量研究證實，哮喘小鼠肺組織內存在NGF和TrKA的高表達[13,14]。酪氨酸激酶A(TrKA)做為NGF的高親和力受體，主要表達在巨噬細胞和T細胞中，尤其是在活化的CD4+T細胞[15]。在與NGF結合后，形成二聚體，經磷酸化，發(fā)揮后續(xù)生物學效應[16]。歐陽若云等[17]研究認為，NGF通過上調TH2型細胞因子的表達，下調TH1型細胞因子的表達，促進并放大了TH1/TH2的免疫失衡，從而介導哮喘的免疫源性炎癥反應。為了進一步研究伏九貼膏調控TH1/TH2平衡的機制，應用免疫組化法檢測伏九貼膏治療后的哮喘小鼠肺組織內NGF和TrKA的表達情況。結果顯示，哮喘小鼠NGF和TrKA的表達量明顯升高，經伏九貼膏治療后，NGF和TrKA的表達量均有不同程度的降低，說明伏九貼膏可能是通過調控NGF/TrKA蛋白的表達使TH1/TH2趨于平衡從而緩解哮喘的發(fā)作。

綜上所述，本研究結果顯示，伏九貼膏通過下調NGF/TrKA蛋白的表達，促進TH1型細胞因子的分泌，抑制TH2型細胞因子的釋放，使TH1/TH2趨于平衡，從而緩解了哮喘的發(fā)作。