徐昊淼，李雅竹，程 涓，趙 勇，許亞梅*

(1. 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700；2.中國科學院動物所，北京 100101)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是髓系造血干/祖細胞惡性疾病，可造成骨髓與外周血中原始和幼稚髓性細胞惡性克隆增殖，臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感染和發(fā)熱、臟器浸潤等癥狀，如不及時治療?？晌＜吧黐1]，因此探索白血病的發(fā)病急機制、尋求有效的治療手段成為我們研究的重點[2-3]。M1細胞來源于自發(fā)性髓系白血病小鼠的骨髓，本研究應用M1細胞構建小鼠白血病模型，通過尾靜脈注射的方式，模擬臨床白血病累及骨髓和全身播散特點，為探索藥物作用機制、篩選評價奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

SPF級BALB/c裸小鼠12只，雌性，5～6周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0006]，體重15～18 g。小鼠于中國科學院動物研究所SPF層流柜中飼養(yǎng)[SYXK(京)-2013-0015]，含復合維生素B的標準顆粒飼料，飲水，墊料及一切與鼠接觸的物品均經(jīng)滅菌處理。實驗室內溫度約為25℃，相對濕度為40%～70%,每日光照時間為12 h，實驗前適應性飼養(yǎng)1周。實驗方案符合3R原則并通過了北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院實驗動物管理和使用委員會(IACUC)審批(2017-39)。

小鼠白血病細胞M1購于上海素爾生物科技有限公司，接種于含有20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基的10 cm細胞培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代。

1.2 主要試劑與儀器

臺式冷凍離心機(美國Thermo Scientific，型號Sorvall Legend RT)，CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(北京利維寧生物科技有限公司)，胎牛血清(天津康源生物技術有限公司)，青霉素和鏈霉素各100 U/ml(Sigma)，流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司，型號EpicsXL)，Anti-Mouse CD117-APC、Anti-Mouse CD33-PE-Cyanine7(ThremoFisher)。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模

將BALB/c裸小鼠分為低、中、高劑量組及空白對照組，每組3只。取對數(shù)生長期的M1細胞，將細胞懸液濃度分別調至每只1×106個、每只5×106個、每只8×106個，在無菌條件下經(jīng)尾靜脈分別注射入低、中、高劑量組小鼠體內，空白組小鼠經(jīng)尾靜脈注射等劑量的生理鹽水。觀察各組小鼠在接種M1細胞后的發(fā)病情況、體重變化及生存時間。

1.3.2 外周血常規(guī)及血涂片的檢查

分別于接種前及接種后第10天、第20天、第30天經(jīng)尾靜脈取外周血約0.1～0.2 mL的加入抗凝管中，送至北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院檢驗科進行血常規(guī)檢查，并制備血涂片，經(jīng)吉姆薩-瑞氏染色后，觀察細胞形態(tài)，計算白血病細胞的比例。

1.3.3 流式細胞技術檢測

CD33是髓系細胞分化抗原，臨床中CD33在90%以上的急性髓系白血病中都有表達，是急性髓性白血病的治療靶標[4]，而對應的鼠源CD33分布在分化早期階段的髓系血細胞中，主要在于小鼠骨髓中的粒細胞和巨噬細胞前體中，此外，CD33也在外周血單核細胞上有少量表達，可作為小鼠白血病細胞的標記進行檢測[5]。CD117也稱為c-Kit，是由c-Kit原癌基因編碼的145×103跨膜酪氨酸激酶，能夠調節(jié)多種生物反應，包括細胞增殖，凋亡，趨化性和粘附[6-7]。c-Kit突變與多種癌癥中的腫瘤生長和進展相關，在急性髓系白血病中可見到c-Kit突變[8-9]。經(jīng)前期實驗檢測小鼠白血病細胞M1表面抗原CD33+CD117+所占比例在90%以上，故采用CD33+CD117+對模型鼠進行鑒定。

尾靜脈外周血。取50 μL外周血加入2 μL肝素抗凝，加入二蒸水9 mL低滲裂解紅細胞及血小板20 s，加入1 mL MPBS終止反應，離心后棄上清并加入1 μL CD117-APC、Anti-Mouse CD33-PE-Cyanine7 搖晃混勻，避光37℃孵育30 min后上機檢測。

1.3.4 組織病理切片

處死后取小鼠肝、脾、腎固定于4%甲醛中，修整形狀后通過梯度酒精法脫去組織中的水分，加入二甲苯使組織透明后進行包埋并切片，切片厚度為2 μm，經(jīng)HE染色后，觀察白血病細胞的浸潤程度。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 小鼠生存狀況

接種細胞后7～15 d后，模型組小鼠出現(xiàn)皮膚粗糙、暗淡無華、脊背弓起、萎靡少動等表現(xiàn)，到實驗后期小鼠逐漸枯瘦、步態(tài)不穩(wěn)，實驗進行過程中小鼠均未出現(xiàn)死亡。(圖1)

與空白組相比，高劑量組小鼠體重顯著下降，低、中劑量組小鼠體重未見明顯變化。(表1)

2.2 血涂片及血常規(guī)檢查

與空白組相比，第30天時，中、高劑量組小鼠外周血白細胞數(shù)明顯升高，高劑量組最為顯著(P<0.05)；第30天時，高劑量組小鼠血紅蛋白量量較空白組明顯降低(P<0.05)，且低于其他各組，低劑量組、中劑量組小鼠血紅蛋白含量與空白組比較未見明顯變化；各組小鼠血小板的比較差異無統(tǒng)計學意義。(表2-4)

圖1 小鼠經(jīng)尾靜脈接種M1細胞后生存狀態(tài)Figure 1 Living state of the miceafter inoculation of M1 cells

表1 BALB/c Nude小鼠各組體重變化(n=3)Table 1 Changes in body weight of the mice in four groups

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the blank group,*P<0.05,**P<0.01.

表2 BALB/c Nude小鼠外周血白細胞計數(shù)變化(n=3)Table 2 Changes in the peripheral blood WBC counts in mice of the four groups

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the blank group,*P<0.05,**P<0.01.

表3 BALB/c Nude小鼠外周血血紅蛋白含量變化Table 3 Changes in HGB of BALB/c Nude mice peripheral blood among five groups

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the blank group,*P<0.05,**P<0.01.

表4 BALB/c Nude小鼠外周血外周血血小板計數(shù)變化Table 4 Changes in the peripheral blood platelets counts in mice of the four groups

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the blank group,*P<0.05,**P<0.01.

鏡下M1細胞多為圓形或卵圓形，細胞核較大約占面積3/4左右，有多個核仁，細胞質為深藍色，見圖2。造模第20天時，每片計數(shù)100個細胞，低、中、高劑量組小鼠外周血均可見到白血病細胞，至第30天時白血病小鼠外周血白血病細胞比例明顯增多，高劑量組最為顯著?？瞻捉M外周血涂片始終未見白血病細胞。(圖2-3,表5)

表5 BALB/c Nude小鼠各模型組外周血涂片白血病細胞比例Table 5 Changes of the proportions of leukemia cells in peripheral blood of mice in the two model groups

圖2 M1細胞形態(tài)(吉姆薩-瑞氏染色，×1000)Figure 2 Cell morphology(Wright-Giemsa staining)

圖3 接種M1后小鼠外周血涂片(吉姆薩-瑞氏，×1000)Figure 3 Morphology of leukemia cells in the peripheral blood of mice after MI cell inoculation(Wright Giemsa staining)

2.3 流式表達變化

與空白組比較，造模第30天時，低、中、高三組小鼠外周血及骨髓中CD33+CD117+細胞比例增高，與注射劑量呈正相關。(表6)

表6 BALB/c Nude小鼠各模型組外周血及骨髓中CD33+CD117+比例變化Table 6 Changes of CD33+CD117+ positive proportion of BALB/c Nude mice

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the blank group,*P<0.05,**P<0.01.

2.4 小鼠臟器組織病理學觀察

高劑量組小鼠肝脾臟中可見多核腫瘤細胞聚集，核仁清、體積大，為白血病細胞浸潤灶；空白組、低劑量組、中劑量組小鼠肝脾中未見明顯白血病細胞浸潤。

各組小鼠肝臟結構完整，未見白血病細胞浸潤。(圖5)

2.5 結論

BALB/c Nude小鼠經(jīng)尾靜脈注射8×106個小鼠白血病細胞M1后可構建急性粒細胞性白血病模型，符合急性髓系白血病的生物學特點，高濃度成瘤更快。

圖4 小鼠外周血及骨髓流式圖Figure 4 Flow cytometric analysis of the mouse peripheral blood and bone marrow cells

圖5 小鼠肝脾組織病理形態(tài)(HE染色，×400)Figure 5 Histo pathological changes of the mouse liver and spleen(HE Staining)

3 討論

前期實驗研究中，通過對SCID beige小鼠照射2GyX線預處理，經(jīng)尾靜脈分別接種了1×107個/只、5×106個/只兩種不同濃度的HL60、HL60/ADR細胞株，建立了發(fā)病時間長，生存期穩(wěn)定人源性白血病模型[10]，本次研究中研究人員采用了鼠源急性髓系白血病M1構建小鼠急性髓系白血病模型，因物種差異小，鼠源細胞相對于人源細胞更容易在小鼠體內生長[11-12]。研究選用BALB/c 裸小鼠作為模型鼠，BALB/c裸小鼠由于無胸腺，不能正常分化T細胞，導致T細胞免疫缺陷，B淋巴細胞正常但功能缺陷，因而為本實驗尾靜脈造模提供了良好的條件[13-14]。目前建立白血病動物模型的方法有多種，包括尾靜脈注射、腹腔注射和皮下注射三種方法[15-17]，其中，尾靜脈造模白血病細胞可隨血液流動全身播散，能更好的模擬臨床白血病累及骨髓和彌漫生長特點，貼近臨床白血病患者的疾病特點[18-19]。

本次研究采用了每只1×106個、5×106個及8×106個三種濃度，通過接種前及接種后第10天、第20天、第30天后對動物模型的形態(tài)學、分子免疫學和組織病理學檢測對比發(fā)現(xiàn)，高濃度組發(fā)病更快，外周血白血病細胞比例均升高明顯，更有利于小鼠成模，這與課題既往造模結果相一致[20]，為后期藥物干預實驗提供了良好的模型基礎。