姜 靜，呂 琦，李楓棣，戚菲菲，王順意，王冠澎，徐艷峰，鮑琳琳

(中國醫(yī)學科學院北京協和醫(yī)學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京 100021)

流感病毒(influenza virus)是引起人和動物傳染病流行最重要的病原體之一，目前已經在世界上導致五次人群中的大規(guī)模流行。自1918年西班牙H1N1流感大流行后，1957年亞洲H2N2、1968年香港H3N2、1977年俄羅斯H1N1及2009年墨西哥H1N1流感大流行相繼出現，造成人力、物力等資源的巨大損失，其中僅在1968～1969 年香港H3N2流感大流行中就有約100 萬人被奪去了生命[1-3]。H3N2自1968年香港大流行以來，幾乎每年均以季節(jié)性流感的形式在我國頻繁出現[4-6]，是我國季節(jié)性流感的主要病毒株，已成為疫苗備選株的重要篩選對象。隨著H3N2亞型流感病毒在人群中不斷的進化、變異，預防流感或流感嚴重并發(fā)癥的疫苗至今也已更新三十余次[7-9]。與以往相比，近年來H3N2發(fā)生了較大變異，導致被感染人的數量顯著增多、癥狀明顯加重[10-13]，亟需開展研發(fā)相應的治療藥物、疫苗等流感疫情應對工作。

BALB/c小鼠是流感病毒致病性與疫苗研究常用的動物模型之一[14-16]。季節(jié)性流感病毒H3N2并不能直接感染小鼠，國際上大多采用建立鼠適應株、反向遺傳學技術構建整合毒株的方式建立小鼠模型[17-23]，目前國內還未建成H3N2流感病毒適應株[24-25]。面對國內目前不斷出現突變的H3N2流感病毒，新型疫苗株篩選、有效性評價急需H3N2動物模型。本文通過篩選合適的H3N2流感病毒株建立H3N2鼠適應株，并應用其建立小鼠模型，將為疫苗株篩選、疫苗和抗體有效性評價提供合適的研究工具，為季節(jié)性流感防控提供有力的實驗室支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

SPF級雌性BALB/c小鼠60 只，4～6 周齡，體重13～15 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0006]。所有的感染實驗均在動物生物安全二級實驗室(ABSL-2)中進行，所有操作經中國醫(yī)學科學院北京協和醫(yī)學院醫(yī)學實驗動物研究所倫理委員會審核并批準(BLL18004)。實驗動物的使用遵循3R原則。

季節(jié)性流感病毒A/Aichi/2/68(H3N2)(WT)，由香港大學陳鴻霖教授惠贈。H3N2鼠適應株(MA-7)由本實驗室在BALB/c小鼠體內7 次適應獲得。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組

4～6 周齡雌性BALB/c小鼠隨機分成2 組，每組30 只，設立WT組(對照組)和MA-7組(實驗組)，分別用A/Aichi/2/68(H3N2)WT和鼠適應株(MA-7)滴鼻感染小鼠，感染劑量為每只106TCID50。在感染后第1、2、3、5、7和第9 天，每個時間點處死3 只小鼠，取肺、心、肝、脾、腎、腸、腦、眼、氣管組織，用于病理檢查、病毒載量和病毒滴度的檢測。

1.2.2 病毒載量測定

提取組織的總RNA，進行探針法熒光定量PCR (Rea1-time PCR)檢測。上、下游引物序列為：InfA-Fwd 5’-GACCGATCCTGTCACCTCTGAC -3’，InfA-Rev 5’- AGGGCATTCTGGACAAAGCGTCTA -3’, InfA-Prb5’FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG -BHQ1-3’。Real-time PCR反應條件為：50℃ 30 min；95℃ 15 min；94℃ 15 s，60℃ 45 s，35 個循環(huán)。

1.2.3 滴度測定

將組織勻漿接種于單層MDCK細胞中，37℃孵育1 h，PBS洗1遍，補充等體積的病毒培養(yǎng)液，72 h后收集細胞上清，加入火雞血進行復檢。利用Reed-Munch公式計算組織細胞半數感染量(TCID50)。

1.2.4 組織病理學檢查

將小鼠的肺、心、肝、脾、腎、腸、腦、眼、氣管組織進行標本制備，制備方法采用甲醛固定、石蠟包埋、切片，H.E和免疫組織化學染色。免疫組化使用NP單克隆抗體(1∶1000稀釋)，4℃過夜，PBS洗；加二抗(1∶1000稀釋)，室溫孵育，PBS洗； DAB顯色，蘇木素襯染后脫水、透明、中性樹膠封片。

1.2.5 基因組測序和比對

合成流感病毒8 個基因片段的PCR引物，對WT和MA-7的8 個基因片段進行高保真PCR擴增。PCR產物純化和測序后使用DNAStar軟件包進行序列拼接及比對。

2 結果

2.1 小鼠一般狀態(tài)和死亡情況

WT組小鼠感染后，無明顯癥狀變化，14 d內無小鼠死亡。MA-7組小鼠感染后，出現弓背、豎毛、活動遲緩、體型消瘦，第4天開始出現死亡，直至第9 天全部死亡。具體死亡情況見圖1。

2.2 小鼠體重變化

WT組小鼠感染后，小鼠體重持續(xù)上升，體重上升率最高可達14%。MA-7 組小鼠感染后第1天體重下降，一直持續(xù)至感染第9 天(小鼠全部死亡)逐漸下降，體重下降率峰值達到30%。小鼠感染后體重變化率見圖2。

圖1 鼠肺適應株小鼠模型的死亡情況(n=10)Figure 1 The survival rate in the mice inoculated with WT and MA-7 virus

注：(a)圖中9組bar依次代表小鼠感染鼠肺適應株(MA-7)后心、肺、氣管、脾、腎、腸、腦、眼、肝的病毒載量；(b) 圖中9組bar依次代表小鼠感染鼠肺適應株(MA-7)后心、肺、氣管、脾、腎、腸、腦、眼、肝的病毒滴度。圖3 鼠肺適應株小鼠模型各組織的病毒復制(n=3)Note. (a) The viral load in tissues of the mice infected with MA-7 virus. (b) The viral titer in tissues of the mice infected with MA-7 virus.Figure 3 Viral replication curves in tissues of the mice infected with MA-7 virus

圖2 鼠肺適應株小鼠模型的體重變化(n=10)Figure 2 The loss of body weight in the mice inoculated with WT and MA-7 virus

2.3 病毒在各組織中復制動態(tài)變化

在小鼠感染后第1～9 天，檢測MA-7組小鼠的肺、心、肝、脾、腎、腸、腦等組織內的病毒復制情況，用于明確病毒復制的組織器官，并監(jiān)測其復制動態(tài)變化，確定復制高峰期。結果顯示，肺、氣管、心、肝、腎均能檢測到病毒復制，其中以氣管和肺組織為主。MA-7組小鼠感染后，在第1～9 天均可在肺組織內檢測到病毒復制，第2～5天為復制高峰期，最高可達到105.5TCID50。病毒在氣管中的復制能力低于肺組織，最高可達105.2TCID50，其可能與兩者的細胞表面受體分布特點相關。心、肝、脾、腎、腸、腦、眼組織均能檢測到病毒RNA，肝、腎組織在小鼠感染后第1～9 天間斷性地檢測到有病毒復制，其余組織均檢測不到。以上結果說明H3N2病毒復制只發(fā)生在呼吸系統(tǒng)中。具體結果如圖3所示。

2.4 小鼠模型的肺組織病理變化

MA-7組小鼠感染后可在肺、氣管、心、肝、腎組織內可檢測到病毒復制，因此進一步比對病毒入侵的這些組織臟器中引起的病理改變。檢測結果顯示，氣管、心、肝、腎組織均無明顯的病理變化。肺組織HE結果顯示，在感染后第1～5 天內，隨著感染天數增加，肺組織病變嚴重程度增大。在感染后第1天，局部肺泡間隔輕度增寬，少數支氣管上皮細胞變性壞死；在感染后第3天，肺泡間隔明顯增寬，支氣管上皮細胞變性壞死，肺泡內可見少量炎細胞滲出，血管周圍水腫，少量出血；在感染后第5天，肺組織呈現病毒性間質肺炎，肺泡間隔增寬程度增加，部分區(qū)域肺泡腔消失，炎細胞浸潤，肺泡內可見較多的炎細胞及漿液纖維素滲出，支氣管上皮細胞變性壞死，血管擴張充血；在感染后第7天，肺組織病變略有減輕。免疫組織化學結果顯示，在感染后第1～5 天內，抗原顆粒隨著感染天數呈現增加的趨勢。

2.5 基因比對

測序分析結果顯示，MA-7 基因序列共檢出5 個突變位點，分別位于第 1891、550、1447、868 及 1192 位，其中2 個突變發(fā)生在 HA 蛋白中(P162Q、N483P)，3 個突變分別發(fā)生在 NA、PA、NP 蛋白中(V398I、 G631S、D290 N)， 引起氨基酸殘基序列改變。具體結果如表1所示。

3 討論

抗流感病毒的藥物、疫苗和抗體評價以及新發(fā)流感病毒的致病性方面的研究都需要合適的動物模型，流感動物模型是藥物轉化應用的必不可少的技術支撐。而近年來H3N2流感病毒不斷變異產生新的毒株，疫苗保護效果不理想，需要不斷提供新的疫苗株，同時也需要更有效的抗病毒藥物；而H3N2流感病毒，野生毒株不能直接感染小鼠[24-26]，沒有合適的動物模型對于進行一些疫苗評價和藥物評價是一個巨大的問題。本研究是應用H3N2流感病毒小鼠適應株建立相應的模型。前期曾應用5株病人分離到的H3N2流感病毒建立小鼠適應株，經過20代左右適應，但病毒不能在小鼠體內復制。另外其他研究機構[27]將H3N2流感病毒(A/Anhui/137/2008)在BALB/c小鼠體內傳代40次，也未能構建H3N2的適應株。本次實驗應用毒株A/Aichi/2/68(H3N2)，通過在BALB/c小鼠體內多次適應，期間通過不斷優(yōu)化組織的處理、病毒的富集方法，連續(xù)傳至7代后獲得敏感的鼠適應株(MA-7)，并在此基礎上成功建立了小鼠模型。以上結果說明并不是所有H3N2流感病毒通過多次循環(huán)能夠獲得小鼠適應性，并在小鼠體內復制。本次構建的H3N2適應株小鼠模型可用于H3N2流感病毒發(fā)病機制及其相應的藥物、疫苗、抗體評價等方面的研究。

MA-7(H3N2適應株)可導致小鼠在感染后9天內死亡，與野生毒株相比致病力顯著提升。實驗人員進行序列分析發(fā)現這種致病力的差異來自于病毒分子序列的改變。結果顯示，MA-7在HA、NA、PA、NP蛋白中出現了5個氨基酸突變，其中2個突變發(fā)生在HA蛋白中(P162Q、N483P)，3個突變分別發(fā)生在NA、PA、NP蛋白中(NA-V398I、 PA-G631S、NP-D290 N)，各位點的突變均未有報道。初步分析MA-7的基因多態(tài)性突變是致病力發(fā)生顯著性提升的分子基礎。上述突變位點的功能確認還需通過反向遺傳學構建相應的突變毒株，逐個鑒定其功能。

注：上行顯示的是4周齡雌性BALB/c小鼠在感染鼠適應株后肺組織HE(100倍)染色結果；下行顯示的是BALB/c小鼠在感染鼠適應株后肺組織IHC(200倍)染色結果。圖4 流感病毒小鼠肺組織病理切片(HE，IHC)(n=3)Note. The upper line shows the results of the lung tissue HE staining of mice at 1,3,5 and 7 days after infection with MA-7 virus. The upper line shows the results of the lung tissue IHC staining of mice at 1,3,5 and 7 days after infection with MA-7 virus.Figure 4 Histological analysis of the lung tissues of the mice infected with MA-7 virus(HE,IHC staining)

病毒VirusPB2PB1PAHANPNAM2&M1NEP&NS1ntaantaantaantaantaa189163155016214474838682901192398WT--GGlyCProAAsnGAspGVal--MA-7--ASerAGlnGAspAAsnAlle--

注：WT： 野生株；MA-7： 鼠適應株； nt, 堿基；aa, 氨基酸。

Note. WT, wild-type. MA-7, mouse-adapted. nt, nucleotide. aa, amino acid.

綜上所述，本次研究成功建立了季節(jié)性流感病毒H3N2適應株小鼠模型，并發(fā)現HA(P162Q、N483P)、NA(V398I)、PA(G631S)、NP(D290 N)5個氨基酸位點突變與其鼠適應株的致病力增強相關，為進一步研究流感病毒鼠肺適應的分子機理奠定了基礎。