宋加興，張清秀，何 磊，魏秀娥*

(1．徐州醫(yī)科大學，江蘇 徐州 221004；2．徐州醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內科，江蘇 徐州 221006)

缺血性腦卒中作為主要的腦血病事件，其危害主要表現(xiàn)為致死率、致殘率高，患者預后較差，給家庭和社會帶來了沉重負擔[1]。盡管對于缺血性腦卒中有大量的研究，但目前有效的治療手段仍較為局限。NMDA受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor)即N-甲基-D-天冬氨酸受體，是離子型谷氨酸受體的一個亞型，對神經(jīng)元及神經(jīng)元的軸突和樹突的結構具有調節(jié)作用，并且參與了突觸可塑性形成[2]。研究表明，在發(fā)生缺血性卒中后，細胞外谷氨酸的大量上升，使細胞外的NMDA受體過度刺激，引起興奮性氨基酸毒性，使腦組織神經(jīng)元損傷和神經(jīng)元可塑性發(fā)生改變[3]。美金剛作為一種非競爭性，低親和力的NMDA受體拮抗劑，目前在臨床上主要應用于阿爾茨海默病的治療。López-Valdés等人[4]實驗顯示，在缺血性卒中發(fā)生后給予美金剛藥物時，實驗模型的急性缺血腦損傷可以減輕。這可能與抑制興奮性氨基酸毒性作用有關。上述實驗給藥時間主要在缺血前預處理給藥，或者急性期缺血后短時間內給藥，主要關注的時間點均為腦缺血急性期的變化。目前尚不清楚在腦缺血急性期后的恢復期給予美金剛,對缺血損傷的作用和相關機制。細胞外信號調節(jié)酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)和其下游的環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)，是NMDA受體下游信號通路分子，參與細胞編碼相關基因和細胞信號轉導，與神經(jīng)系統(tǒng)的功能有關[5]。本實驗在小鼠腦缺血后24 h后給予美金剛干預，研究美金剛對于腦缺血急性期后恢復期的相關作用和可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取SPF級8～10周齡C57/BL6J雄性小鼠60只，體重23～26 g，實驗動物購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[SCXK(魯) 2014-0007]。動物飼養(yǎng)于徐州醫(yī)科大學動物中心屏障系統(tǒng)[SYXK(蘇)2016-0028]，溫度25℃，相對濕度50%，維持正常晝夜節(jié)律。動物自由進食進水。實驗經(jīng)徐州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審查批準(IACUC：2018051803)。實驗動物在使用中遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

甲酚紫染料(美國Solarbio公司)，MCAO硅膠線栓(中國廣州佳靈生物技術有限公司，型號1800/1900)，美金剛試劑(中國MedChemExpress有限公司)，戊巴比妥鈉試劑(上海容創(chuàng)生物技術有限公司)，OCT冰凍切片包埋劑(美國Sakura公司)，其中兔抗多克隆ERK、p-ERK抗體和兔抗多克隆CREB、p-CREB抗體(美國CST公司)，兔抗多克隆PSD-95和Synaptophysin抗體(中國Proteintech公司)，兔二抗及ECL發(fā)光液(中國碧云天公司)。

冰凍切片機(萊卡CM1950)，光學顯微鏡(奧林巴斯BX43)，體視顯微鏡(中國Motic公司)，Western Blot相關設備(美國Bio-Rad公司)，動物行為學設備(中國瑞沃德有限公司)，動物行為學分析軟件(美國Harvard Apparatus公司)，小鼠激光多普勒血流儀(中國武漢優(yōu)爾生生命科學裝備有限公司)

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與給藥

按照隨機數(shù)字法將60只C57/BL6J雄性小鼠隨機分組為假手術組(Sham)、模型組(MCAO)、美金剛20 mg/kg組(M20)、美金剛4 mg/kg組(M4)及生理鹽水組(NS)，每組12只。美金剛藥物濃度參考Culmsee 等人實驗[6-7]。給藥方式為腹腔注射，首次給藥時間點在缺血再灌注24 h后給藥，其后每天固定時間點腹腔給藥1次，持續(xù)給藥4周。

1.3.2 小鼠腦缺血再灌注模型

2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后，仰臥位固定行頸部正中切口，使用血管鑷鈍性分離出右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈分支，使用7-0縫合線在頸總動脈及頸外動脈處打活結備用，并用動脈夾暫時夾閉頸內動脈，用血管剪在頸外動脈處剪一小缺口，將硅膠線栓自頸外動脈缺口處插入，此時松開動脈夾，線栓順勢緩慢插入頸內動脈，當線栓插入深度距頸動脈分叉處8.5 mm左右感到輕微阻力時停止進栓，并用預留縫合線固定線栓，將小鼠放入37℃恒溫箱中保溫，缺血60 min后，拔出線栓，結扎血管，縫合皮膚，放入恒溫箱中直至小鼠完全蘇醒，放入飼養(yǎng)箱中。假手術組僅鈍性分離各個血管。為了保證造模成功率，在手術前，術中和復灌后使用激光多普勒血流測量法測量局部腦血流量。術中腦血流下降至基線80%以下，復灌后腦血流上升至80%以上為造模成功。復灌后模型組小鼠死亡2只，美金剛20 mg/kg組(M20)死亡3只、美金剛4 mg/kg組(M4)死亡3只及生理鹽水組(NS)死亡3只，后續(xù)補充造模至每組12只樣本。

1.3.3 小鼠腦萎縮體積測定

參考Cai等人[8]方法，腦組織冰凍切片，每隔0.4 mm一片腦片貼于載玻片上(前囟1.3～-2.7 mm之間)，將貼好的玻片放入濃度0.1%的甲酚紫溶液中15 min，放入去離子水中1 h后晾干，顯微鏡下拍照，用Image J軟件計算小鼠腦萎縮體積，將腦片正常側面積減去梗死側的面積，即萎縮面積，腦萎縮體積計算公式為V=1/3×h×(S1+S2+√S1×√S2)，其中h為相鄰兩片腦片的間隔，此處h為0.4 mm。

1.3.4 小鼠體重變化

術前及術后1～5周時間點稱量小鼠體重，并與術前體重進行比較。體重變化=術后各時間點體重—術前體重，記錄相應數(shù)值。操作采用單盲方法，即評估者對動物分組不知情。

1.3.5 改良神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)

參考Choi等人[9]方法，在術前及術后的1～5周時間點進行神經(jīng)功能評分，評估內容包括小鼠的運動，反射與平衡功能，評分結果在0～14分之間，分數(shù)越高，則表明動物損傷越嚴重。操作采用單盲方法，即評估者對動物分組不知情。

1.3.6 粘附物去除實驗(Adhesive removal test)

參考Ma等人[10]方法，用粘附物去除實驗評估動物的感覺和運動功能變化。實驗時將小鼠左前爪無毛區(qū)域覆蓋一3 mm×4 mm大小的膠帶，每只小鼠粘貼的力度和方式應保持一致。貼完后將小鼠放入飼養(yǎng)籠中，觀察并記錄小鼠接觸膠帶和撕去膠帶的時間，觀察時長為120 s，實驗重復三次，取結果的平均值。在小鼠手術前，應提前每天訓練1次，持續(xù)3 d，然后在手術后的1～5周進行實驗。接觸的定義為小鼠爪子出現(xiàn)搖晃或用嘴觸碰膠帶。

1.3.7 小鼠Morris水迷宮試驗(Morris water maze)

在術后的第5周時，提前將小鼠轉移至水迷宮房間適應環(huán)境，水迷宮水池直徑121 cm，深度為45 cm，直徑10 cm的平臺在水下深度為1 cm，池水溫度保持在21℃～22℃之間。(1)定位航行實驗：每只小鼠每天訓練4次，共訓練4 d。第1天訓練時，將小鼠面向池壁沿水面放入水池中，4個象限各放入一次，開始記錄小鼠找到隱藏在水下平臺的時間，即逃避潛伏期；如果60 s內小鼠未找到平臺，則將小鼠引導至平臺，并使其在平臺停留10 s學習記憶平臺所在位置，結束后將小鼠移走，進行下一只實驗動物。第2～4天的操作過程同第1天。(2)空間探索實驗：在第5天時，撤掉位于水下的平臺，將小鼠面朝池壁，從平臺所在對側象限放入水中，行為學軟件記錄1 min內小鼠在平臺所在象限時間，穿臺次數(shù)和空間探索實驗僅進行一次。

1.3.8 蛋白印跡實驗(Western blot)

每組取4只樣本，術后5周時間點處死小鼠，提取缺血側腦組織勻漿后，加入細胞裂解液，蛋白溶解酶抑制劑裂解，置于4℃離心機12 000 r/min，離心10 min，移取上清液獲取蛋白。采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白變性、上樣、進行凝膠電泳、轉膜(濕轉法)。一抗孵育，4℃過夜；二抗室溫孵育1～2 h，配制ECL發(fā)光液發(fā)光、顯影，然后用Image J軟件進行蛋白條帶分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 美金剛對腦缺血小鼠體重與神經(jīng)功能評分的影響

術后小鼠體重變化結果提示，在第4～5周時，與模型組(MCAO)、美金剛4 mg/kg組(M4)和生理鹽水組(NS)相比，美金剛20 mg/kg組(M20)的小鼠體重明顯增加，并且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。術后小鼠神經(jīng)功能缺損評分提示，在第3～5周時，與模型組(MCAO)、美金剛4 mg/kg組(M4)和生理鹽水組(NS)相比，美金剛20 mg/kg組(M20)小鼠神經(jīng)功能缺損程度明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(見圖1)

2.2 美金剛對腦缺血小鼠腦萎縮體積的影響

腦組織冰凍切片甲酚紫染色結果提示，與模型組(MCAO)、美金剛4 mg/kg組(M4)和生理鹽水組(NS)相比，美金剛20 mg/kg組(M20)小鼠腦萎縮體積較其他組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(見圖2)

2.3 美金剛對腦缺血小鼠粘附物去除實驗結果的影響

術后小鼠粘附物去除實驗結果提示，在第3～5周時，與模型組(MCAO)、美金剛4 mg/kg組(M4)和生理鹽水組(NS)相比，美金剛20 mg/kg組(M20)小鼠開始接觸膠帶與去除膠帶的時間均出現(xiàn)明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(見圖3)

2.4 美金剛對于腦缺血小鼠Morris水迷宮實驗結果的影響

術后第5周開始進行水迷宮實驗，空間探索實驗結果提示，在實驗開始的第2～4天，美金剛20 mg/kg組小鼠可以更快的找到隱藏在水下的平臺，表現(xiàn)為平臺潛伏期明顯下降，與其他三組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；定位航行實驗中：美金剛20 mg/kg組小鼠穿臺次數(shù)較其他三組明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；美金剛20 mg/kg組小鼠在平臺所在象限停留時間明顯多于其他三組小鼠停留時間，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在第5天的定位航向實驗中，各組小鼠的游泳速度表明各組小鼠游泳能力無差異(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學意義。(見圖4)

注：美金剛20 mg/kg組(M20)與模型組(MCAO)相比，*P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與美金剛4 mg/kg組(M4)相比，#P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與生理鹽水組(NS)相比，&P<0.05。圖1 小鼠體重變化和小鼠mNSS評分變化(n=12)Note. M20 group compared with MCAO group ，*P<0.05.M20 group compared with M4 group ，#P<0.05.M20 group compared with NS group，&P<0.05.Figure 1 Changes in body weight and mNSS scores in the mice

注：美金剛20 mg/kg組(M20)與模型組(MCAO)相比，*P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與美金剛4 mg/kg組(M4)相比， #P<0.01；美金剛20 mg/kg組(M20)與生理鹽水組(NS)相比，&P<0.05。圖2 小鼠腦缺血后腦萎縮體積變化(甲酚紫染色)(n=8)Note.M20 group compared with MCAO group ，*P<0.05.M20 group compared with M4 group，#P<0.05.M20 group compared with NS group，&P<0.05.Figure 2 Changes of brain atrophy volume after cerebral ischemia in the mice (cresyl violet staining)

2.5 美金剛對于腦缺血小鼠缺血腦組織中ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、p-CREB蛋白的影響

分別以p-ERK1/2/ ERK1/2、p-CREB/ CREB的比值作為ERK1/2與CREB活化表達的衡量標準，與模型組(MCAO)、美金剛4 mg/kg組(M4)和生理鹽水組(NS)相比，美金剛20 mg/kg組(M20)的磷酸化的ERK1/2、CREB的表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(見圖5)

2.6 美金剛對于腦缺血小鼠缺血腦組織中PSD-95，synaptophysin蛋白的影響

與模型組(MCAO)、美金剛4 mg/kg組(M4)和生理鹽水組(NS)相比，美金剛20 mg/kg組(M20)的PSD-95，synaptophysin蛋白的表達明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(見圖6)

注：美金剛20 mg/kg組(M20)與模型組(MCAO)相比，*P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與美金剛4 mg/kg組(M4)相比，#P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與生理鹽水組(NS)相比，&P<0.05。圖3 小鼠粘附物去除實驗結果比較(n=12)Note. M20 group compared with MCAO group，*P<0.05.M20 group compared with M4 group，#P<0.05.M20 group compared with NS group，&P<0.05.Figure 3 Results of mouse adhesive removal test

注：美金剛20 mg/kg組(M20)與模型組(MCAO)相比，*P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與美金剛4 mg/kg組(M4)相比，#P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與生理鹽水組(NS)相比，&P<0.05。圖4 小鼠Morris水迷宮實驗結果比較(n=12)Note.M20 group compared with MCAO group，*P<0.05.M20 group compared with M4 group，#P<0.05.M20 compared with NS group，&P<0.05.Figure 4 Results of mouse Morris water maze test

注：美金剛20 mg/kg組(M20)與模型組(MCAO)相比，*P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與美金剛4 mg/kg組(M4)相比，#P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與生理鹽水組(NS)相比，&P<0.05。圖5 小鼠腦組織ERK1/2與CREB蛋白含量比較(n=4)Note. M20 group compared with MCAO group，*P<0.05.M20 group compared with M4 group，#P<0.05.M20 group compared with NS group，&P<0.05.Figure 5 ERK1/21/2 and CREB protein contents in the mouse brain tissue

注：美金剛20 mg/kg組(M20)與模型組(MCAO)相比，*P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與美金剛4 mg/kg組(M4)相比，#P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與生理鹽水組(NS)相比，&P<0.05。圖6 各組小鼠腦組織PSD-95與synaptophysin蛋白含量比較(n=4)Note.M20 group compared with MCAO group，*P<0.05.M20 group compared with M4 group，#P<0.05.M20 group compared with NS group，&P<0.05.Figure 6 PSD-95 and synaptophysin protein contents in brain tissue of the mice

3 討論

缺血性卒中起病急，治療時間窗窄。在腦缺血急性期后，如何最大程度的保護缺血半暗帶神經(jīng)元的存活，提高神經(jīng)元的可塑性，是目前眾多基礎研究的方向。本實驗采用線栓法構建小鼠局灶性腦缺血再灌注模型，較好的模擬了人類腦缺血發(fā)病后靜脈溶栓或介入取栓后，腦缺血再灌注損傷的發(fā)病過程和損傷機制。

腦缺血再灌注損傷后，突觸后膜NMDA 受體激活，鈣離子通道開放，細胞外的鈣離子大量進入細胞內，引起興奮性氨基酸毒性損傷[11]。美金剛作為NMDA受體拮抗劑，可以干預興奮性氨基酸毒性引起的腦缺血再灌注損傷。小鼠腦缺血急性期給予美金剛預處理，可以減輕腦組織的梗死體積和神經(jīng)元損傷，減輕細胞凋亡，減輕血管神經(jīng)單元的損傷[12]。既往Wang等[7]研究表明，小鼠腦缺血后持續(xù)皮下給予美金剛，小鼠的運動功能損傷改善，小鼠腦組織紋狀體萎縮體積下降，腦源性神經(jīng)生長因子及血管生長因子表達增加。小鼠腦缺血后美金剛口服治療，小鼠7 d內行為學結果及腦梗死體積未出現(xiàn)明顯改善；但在持續(xù)給予美金剛28 d后，小鼠轉筒實驗及網(wǎng)格實驗行為學結果出現(xiàn)改善，腦組織中星形膠質細胞增生減少，新生血管密度增加[4]。

ERK1/2與CREB是NMDA受體下游信號通路的蛋白分子，ERK1/2在細胞的生長、分化中發(fā)揮作用；下游的CREB參與認知學習及長時程記憶，參與細胞信號轉導，與神經(jīng)元的生長、發(fā)育相關。其中ERK1/2、CREB蛋白的生物活性與其磷酸化水平是相關的。腦缺血損傷時，由于興奮性氨基酸的毒性作用，組織與細胞損傷加重，ERK1/2活性受到抑制，其下游的CREB活性受到抑制，另外其下游的Bcl-2及BDNF的活性也受到影響，認知學習功能受損[13]。小鼠腦缺血損傷后，腦組織中ERK1/2和CREB活性受到抑制，磷酸化表達水平明顯下降；當缺血組織中ERK1/2被激活后，可以抑制鈣離子內流，抑制NMDA活性，下游的CREB激活，從而減輕興奮性氨基酸毒性造成的神經(jīng)元損傷，減輕了動物的認知記憶功能，改善了突觸可塑性[14-15]。本研究顯示，美金剛20 mg/kg組干預后，小鼠的缺血側腦組織中p-ERK1/2及p-CREB蛋白表達明顯升高，而總的ERK1/2及CREB 蛋白含量無明顯變化，小鼠Morris水迷宮實驗提示缺血小鼠的學習記憶功能損傷明顯改善。

突觸后致密物-95(postsynaptic density-95，PSD-95)是位于突觸后膜的一種腳手架蛋白。突觸素(synaptophysin)是一種突觸囊泡部位鈣結合蛋白。正常情況下，PSD-95與突觸素，在突觸連接的生成及維持中，在NMDA受體信號轉導具有重要作用；兩者與腦組織的突觸可塑性及學習認知功能關系密切[16-17]。腦缺血損傷時，缺血側腦組織的PSD-95及synaptophysin蛋白表達明顯下降，而腦缺血損傷得到抑制時，PSD-95及synaptophysin表達上調[18-19]。本研究顯示，腦缺血美金剛20 mg/kg組干預后，缺血側腦組織的PSD-95、synaptophysin的蛋白表達明顯上升，改善了腦缺血小鼠的突觸可塑性及學習認知功能。

綜上，腦缺血再灌注后持續(xù)美金剛治療，可以促進小鼠的神經(jīng)功能損傷的恢復，改善小鼠的認知記憶功能，改善腦組織的突觸可塑性表達。這種延遲的神經(jīng)保護作用，可能與美金剛激活ERK、CREB信號通路和上調PSD-95及synaptophysin蛋白的表達有關。這為臨床中缺血后卒中病人認知功能障礙的預后治療，提供了新的思路。