王德利，楊 華，湯海峰,王宇石

(1.吉林大學生命科學學院,吉林 長春130012;2.吉林大學口腔醫(yī)學院，吉林 長春130021)

在真核生物中，存在一類由鈣離子介導的的膜磷脂結(jié)合蛋白——膜聯(lián)蛋白Annexin家族，酵母和原核生物中未發(fā)現(xiàn)存在。Annexin最早是在勞什肉瘤病毒轉(zhuǎn)化的雞胚細胞中發(fā)現(xiàn)的。已發(fā)現(xiàn)的Annexin家族成員歸為五類:A類為脊椎動物膜聯(lián)蛋白；無脊椎動物膜聯(lián)蛋白屬于B類；真菌和部分單細胞真核生物被歸為C類；D類為植物膜聯(lián)蛋白；原核生物的膜聯(lián)蛋白家族屬于E類；另外還有40余種膜聯(lián)蛋白仍待歸類[1]。現(xiàn)已鑒定出人體內(nèi)12種膜聯(lián)蛋白家族成員(Annexin A1-A11，A13)，廣泛分布于胎盤滋養(yǎng)細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞內(nèi)外[2]。膜聯(lián)蛋白具有特異性的氨基端(表現(xiàn)在序列或長度各異)以及高度保守的羧基端。不同的膜聯(lián)蛋白家族成員N端不同，而正是由于蛋白N端特異的結(jié)構(gòu)域賦予了不同的膜聯(lián)蛋白獨特的功能[3]。Annexin核心位于羧基端，類似圓盤狀，由約70個氨基酸殘基組成。圓盤凸起面具有鈣離子結(jié)合位點(所以在儲鈣離子的細胞器周圍也能發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白分布)，該結(jié)合位點由C端核心區(qū)域高度保守的膜聯(lián)蛋白重復序列編碼。已證實的Annexins的主要功能包括介導胞吞胞吐途徑、對細胞骨架的調(diào)節(jié)作用、影響膜的通透性等[4]。氨基末端的特異氨基酸是結(jié)合信號轉(zhuǎn)導蛋白激酶的磷酸化位點，此外，氨基末端還具有S100A10蛋白二聚體的結(jié)合位點(S100A10蛋白是一類EF手型Ca2+結(jié)合蛋白)[3，5]。

Annexin A2是膜聯(lián)蛋白家族中的一員，又稱胎盤抗凝集蛋白，p36，具有穩(wěn)定細胞骨架和促進纖溶酶產(chǎn)生的作用，該蛋白還含有mRNA的結(jié)合位點[6]。作為鈣依賴型結(jié)合蛋白的一員，Annexin A2不同于其余各類膜聯(lián)蛋白家族成員之處在于能與包膜糖蛋白B結(jié)合[7]，而這種結(jié)合是非鈣離子依賴的。Annexin A2在細胞內(nèi)外均有存在，但是Annexin A2不含有信號肽序列，所以推測Annexin A2出細胞膜是由另一種機制所介導的[8]。另外，研究表明，Annexin A2的表達失調(diào)與腫瘤的形成和發(fā)展關(guān)系密切，相關(guān)資料提示它可能在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移機制的形成過程中起重要作用，且具有組織特異性，即對不同類型的腫瘤其表達水平不同[9]。比如在宮頸癌中表達上調(diào)，而在前列腺癌中表達下調(diào)[10]。Annexin A2在高轉(zhuǎn)移惡性腫瘤中的異常表達，提示我們可以把Annexin A2 作為腫瘤基因治療的靶分子，通過抑制其表達或中斷其介導的信號轉(zhuǎn)導通路，為抗腫瘤治療提供新的思路[11，12]。因此，獲得全長Annexin A2蛋白質(zhì)，對Annexin A2的深入研究具有重要的推動意義。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞Hep G2、原核表達載體pEXS-GST、大腸桿菌菌株DH5α以及大腸桿菌菌株BL21由實驗室提供。Fast-Pfu、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、GST親和樹脂購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶、連接酶、RNA提取試劑盒DNA marker、PP蛋白酶購于Thermo Scientific。分子克隆、電泳、大腸桿菌培養(yǎng)所需生化試劑購于北京化工廠。

1.2 方法

1.2.1目的基因的獲取

以人肝癌HepG2 cDNA為模板，利用Fast-Pfu和Annexin A2特異性引物(F:5’-TTGGATCCATGTCTACTGTTCACGAAATCCT-3’，R:5’-CCGCTCGAGTCATCTCCACCACACAGGTACA-3’) 進行擴增。PCR反應(yīng)設(shè)置1個循環(huán)預(yù)變性(94℃，5 min)、30個循環(huán)進行擴增(94℃，20 s；62℃，20 s；72℃，80 s)以及一個循環(huán)完成擴增(72℃，10 min)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳和膠回收進行收集。

1.2.2重組載體構(gòu)建

回收的PCR產(chǎn)物和原核表達載體pEXS-GST分別使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ進行酶切反應(yīng)(37℃，2h)。酶切反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳和膠回收進行收集，按照PCR片段：質(zhì)粒=3:1的比例進行連接(16℃，1h)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，37℃倒置培養(yǎng)過夜。單克隆經(jīng)雙酶切鑒定和測序，最終獲得重組載體pEXS-GST-Annexin A2。重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得重組人源Annexin A2表達菌。

1.2.3重組Annexin A2-GST誘導表達

Annexin A2表達菌利用LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待OD600達到1.0加入1 mM IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集菌體。配置聚丙烯酰胺凝膠(上層5%，下層12%)，利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測Annexin A2的表達。

1.2.4重組人源Annexin A2蛋白質(zhì)的純化

活化凍存的Annexin A2-GST表達菌，于1 L LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至OD600達到1.0。加1 mM IPTG，16℃培養(yǎng)過夜，收集菌體。利用溶菌酶裂解菌體，10 000×g 30 min離心去除沉淀，上清加入GST親和層析柱。待裂解液與樹脂充分結(jié)合，棄上清，洗雜，樹脂加入PP蛋白酶4℃反應(yīng)12 h。反應(yīng)液經(jīng)高效液相色譜濃縮，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白質(zhì)的含量。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物鑒定

用RNA提取試劑盒提取人體肝癌細胞RNA，以全RNA為模板，Anchored Oligo(dT)18為引物，反轉(zhuǎn)錄出全cDNA。再以cDNA為模板，Pfu酶催化，PCR擴增出目的基因產(chǎn)物，進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的基因大小約為1 000 bp，這與已報道的ANXA2的大小一致。結(jié)果如圖1。

圖1 Annexin A2 基因的PCR產(chǎn)物

2.2 目的基因和質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

以大腸桿菌DH5α為質(zhì)粒來源，按質(zhì)粒提取試劑盒的要求和步驟提取質(zhì)粒載體，對目的基因和質(zhì)粒構(gòu)建載體進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳對雙酶切的結(jié)果進行檢驗，結(jié)果如圖2。泳道0為Maker，泳道1中出現(xiàn)約1000bp大小的條帶，進一步說明PCR產(chǎn)物中目的基因Annexin A2的存在；泳道2上樣是雙酶切的質(zhì)粒，僅出現(xiàn)一條帶，驗證質(zhì)粒雙酶切。對目的基因和質(zhì)粒進行雙酶切也能實現(xiàn)目的基因和質(zhì)粒構(gòu)建載體的分離和回收。

圖2 目的基因和質(zhì)粒載體雙酶切電泳圖

2.3 篩選轉(zhuǎn)化子

將重組表達載體Annexin A2-DH轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，用含氨芐青霉素的LB平板成功篩選出轉(zhuǎn)化子。LB培養(yǎng)板含氨芐霉素，由于質(zhì)粒pEXS-GST攜帶氨芐霉素抗性基因，所以能進行抗性篩選。導入質(zhì)粒載體的菌落能在平板上生長，不排除質(zhì)粒自連接。從平板上挑選4個大小合適的單克隆菌落，編號為1、2、3、4，分別移入5 ml LB液體培養(yǎng)基，過夜擴增培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。結(jié)果如圖3，泳道 3有約1 000 bp的條帶出現(xiàn)，說明編號3的菌落質(zhì)粒成功連接并克隆重組子，即菌落3是帶有重組子的菌落，而菌落1、2、4對應(yīng)的泳道均未出現(xiàn)目的基因條帶，其原因可能在于質(zhì)粒的自連接，導致目的基因和質(zhì)粒載體未成功連接。而由于質(zhì)粒帶有氨芐霉素抗性基因，故能夠在涂有Amp的培養(yǎng)基上生長，這也是必須進行雙酶切進一步鑒定重組是否成功的原因所在。切下含有ANXA2的凝膠條進行目的基因的回收，送到測序公司進行測序。測序結(jié)果驗證與GenBank上的ANXA2序列結(jié)果一致。測序結(jié)果與GenBank序列比對見圖4。

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.4 重組蛋白表達鑒定

Annexin A2的表達實驗篩選出重組子，即3號單菌落含克隆重組子。以測序驗證正確的重組質(zhì)粒(即3號單菌落對應(yīng)的重組質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)培養(yǎng)后加入誘導物IPTG，誘導重組蛋白的表達，培養(yǎng)5 h后，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠檢驗重組蛋白的表達。脫色漂洗后制干膠保存。結(jié)果顯示55-70 kD之間的區(qū)域出現(xiàn)明顯的條帶，這與Annexin A2-GST蛋白的分子量(約為62 kD)相當，符合預(yù)期。圖5中，與對照組(誘導前)的對比，實驗組條帶顏色較深，說明重組目的蛋白的含量多；而對照組該條帶明顯淺于實驗組，說明目的蛋白含量少。結(jié)果符合預(yù)期。

圖4 測序結(jié)果GenBank序列比對

圖5 Annexin A2-GST蛋白質(zhì)誘導表達

2.5 重組人源Annexin A2的表達和純化

蛋白質(zhì)純化的各組分經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析顯示，表達菌中包含重組Annexin A2-GST蛋白質(zhì)(約62kD)，經(jīng)GST親和樹脂純化后，洗脫液中基本不包含雜質(zhì)蛋白質(zhì)，而GST親和樹脂上也僅包含PP蛋白酶降解余下的GST片段(圖6A)。通過高效液相色譜檢測酶切反應(yīng)液，反應(yīng)液中組分相對單一，可直接分離獲得高純度的重組人源Annexin A2蛋白質(zhì)(圖6B)，滿足試驗的預(yù)期，可利用此方法獲得Annexin A2純品蛋白質(zhì)。

3 討論

隨著基因工程的發(fā)展，越來越多的原核和真核生物被應(yīng)用到外源蛋白的表達上來，而大腸桿菌因為遺傳背景清楚、易于操作、發(fā)酵便利等優(yōu)勢，普遍應(yīng)用于多種外源蛋白的表達以及質(zhì)粒的提取。為了適應(yīng)不同應(yīng)用的要求，研究者改造大腸桿菌菌株，得到了多種不同用途的菌株，如適用于質(zhì)粒擴增的E.coli DH5α和用于表達的E.coli BL21菌株，本文借助大腸桿菌構(gòu)建Annexin A2的原核表達體系，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒并表達目的蛋白。本文根據(jù)Annexin A2的基因序列和BamHⅠ和XhoⅠ酶的酶切位點，設(shè)計并購買引物序列。從人肝癌細胞Hep G2中提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，PCR得到目的基因片段，再與從E.coli DH5α中提取的質(zhì)粒構(gòu)建載體pEXS-GST連接成重組子，轉(zhuǎn)化E.coli BL21并表達目的蛋白Annexin A2，從而得到了在原核生物中構(gòu)建質(zhì)粒載體并成功轉(zhuǎn)化和表達Annexin A2蛋白的方法。為后續(xù)研究Annexin A2蛋白在脊椎動物體內(nèi)的生理學功能提供了基礎(chǔ)。但由于Annexin A2在人體內(nèi)參與多種生理途徑以及在不同腫瘤中的不均一表達，為其發(fā)展為癌癥治療的潛在靶點提出了挑戰(zhàn)。

(A)和高效液相色譜(B)檢測純化的Annexin A2蛋白質(zhì)。