黃宇欣，黃艷智，許 冰，曹 瑩，謝雨欣，高海成，尹光浩，支晨陽(yáng)

(1.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130000；2.長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院；3.吉林大學(xué)；4.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病(DM)的并發(fā)癥之一，可引發(fā)心力衰竭、心律失常、心源性休克，重者可誘發(fā)猝死[1,2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，組織型轉(zhuǎn)谷酰胺酶(tTG)可在多種疾病中發(fā)揮重要的作用，如癌癥、心肌纖維化、肝纖維化、肺纖維化及腎纖維化等[3]。為了進(jìn)一步證實(shí)tTG在DCM中的作用，本實(shí)驗(yàn)利用降糖護(hù)心片干預(yù)由鏈尿佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的大鼠DCM模型，分析tTG在DCM中的表達(dá)，由此明確tTG在DCM中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，由上海士鋒生物科技有限公司提供； MD-100自動(dòng)生化分析儀(美國(guó))； 徠卡4215切片機(jī)(德國(guó))；Olympus PM-10AO全自動(dòng)顯微照相裝置(日本)；tTG抗體和通用型SP kit試劑盒(Invitrogen)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理

雄性Wistar大鼠15只，體重180-220 g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=5)和模型組(n=10)。正常組用生理鹽水刺激；而模型組注射30 mg/kg STZ造模，空腹血糖≥7.8 mmol/L即為造模成功。造模4 w后，隨機(jī)將模型組分為模型組(n=5)和模型組+降糖護(hù)心片干預(yù)組(n=5)，除正常組和模型組用生理鹽水刺激后，模型組+降糖護(hù)心片干預(yù)組，每天灌胃給予降糖護(hù)心片溶解液，至8 w后處死大鼠，取心臟組織用于HE染色、tTG組織化學(xué)染色以及拉蔓光譜檢測(cè)。

1.3 HE學(xué)染色

10%福爾馬林固定標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋、切片。二甲苯脫臘10 min，100%乙醇換二甲苯2 min、95 %、80%及75 %乙醇置換1 min，水沖洗2 min。蘇木素5 min。鹽酸乙醇分化30 s。浸泡15 min。伊紅染2 min。脫水，透明，封片。

1.4 tTG免疫組織化學(xué)染色

新鮮大鼠心臟組織通過(guò)固定、石蠟包埋、切片后，脫蠟至水。PBS洗 5 min，3% H2O2孵育；PBS洗掉H2O2，滴加tTG一抗過(guò)夜；再按通用型二抗試劑盒說(shuō)明書(shū)按步驟執(zhí)行染色；封片后，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算tTG在心肌組織中陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 紫外吸收光譜法

心臟組織經(jīng)勻漿后，利用紫外吸收光譜分析心臟組織蛋白的波譜變化(嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)執(zhí)行)。選用UV-2450光譜在200-1 000 nm處檢測(cè)勻漿液的吸收，由此分析心肌蛋白吸收譜改變 (nm)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 紫外檢測(cè)心肌病變結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)選用紫外吸收光譜分析STZ誘導(dǎo)心肌損傷情況，進(jìn)而判定模型是否構(gòu)建成功。而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：正常對(duì)照組出現(xiàn)三個(gè)明顯的吸收峰，峰值分別是0.891,0.799 和 0.433。其吸收波長(zhǎng)分別是539,576 和 972 nm。在注射STZ誘導(dǎo)的心肌組織后，其峰位移動(dòng)，吸收值向左或向右移動(dòng)1個(gè)單位，說(shuō)明心肌組織蛋白成份發(fā)生改變(圖1)。

2.2 HE染色結(jié)果

正常對(duì)照組心肌排列整齊，橫紋清晰，有明顯的胞核，無(wú)腫脹細(xì)胞。注射給予30 mg/kg STZ后大鼠心肌排列紊亂，局部心肌出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死，心肌出現(xiàn)明顯的損傷。而給予降糖護(hù)心片后心肌排列逐漸整齊，胞核漸清晰(見(jiàn)圖2A-C)。

2.3 tTG免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

正常心肌細(xì)胞排列整齊，橫紋清晰可見(jiàn)，有少量tTG表達(dá)，其灰度值為5.26±0.08(圖3A)；在圖3B中，tTG的陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，其灰度值為14.26±0.05**(P<0.01)，說(shuō)明tTG在DCM中可能扮演重要的作用，可作為DCM診斷的重要靶向因子。為了進(jìn)一步分析tTG在DCM中的作用，我們采用降糖護(hù)心片進(jìn)行大鼠DCM干預(yù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，tTG的陽(yáng)性表達(dá)減弱，其灰度值是8.52±0.04(*P<0.05)，這一結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明tTG在DCM中起著重要的作用(圖3C)。

圖1 紫外吸收光譜測(cè)定心肌組織蛋白的結(jié)果 (A：正常組；B：模型組)

圖2 心臟組織的HE染色 (A：正常組；B模型組；C降糖護(hù)心片組)

圖3 心肌組織中tTG組織化學(xué)染色 (A：正常組；B：模型組；C：降糖護(hù)心片組)**P<0.01，*P<0.05

3 討論

糖尿病是由遺傳因素，環(huán)境因素而造成的體內(nèi)胰島素不足，代謝紊亂性疾病[4]。近年來(lái)，隨著人民生活水平的提高、人口老齡化和生活模式的改變，糖尿病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[5]。DCM是糖尿病的并發(fā)癥，由于其發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，因此深入研究其發(fā)病機(jī)制成為當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。

拉曼光譜(Raman spectra)，是一種散射光譜。它在不損傷細(xì)胞的條件下，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地分析細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)變化，具有敏感性高、活樣品不需固定或染色等眾多特點(diǎn)[6]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜可快速地檢測(cè)STZ誘導(dǎo)的大鼠糖尿病后的心肌損傷，可作為臨床上診斷心肌損傷的快捷工具。近年來(lái)，我室一直致力于DCM發(fā)病機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)tTG在DCM中呈現(xiàn)高表達(dá)，由此推測(cè)tTG可能是治療DCM新的靶點(diǎn)[7]。tTG除在肝臟中表達(dá)豐富外，還可能在心臟、肺、腎、脾等器官中呈高表達(dá)[8]。而前期實(shí)驗(yàn)恰恰證實(shí)，tTG在DCM中起到重要的作用。為了進(jìn)一步分析tTG在DCM中的作用，我們采用降糖護(hù)心片干預(yù)由STZ誘導(dǎo)的大鼠DCM模型，發(fā)現(xiàn)降糖護(hù)心片降低了tTG的蛋白表達(dá)，由此進(jìn)一步證實(shí)了tTG在DCM中的作用，該成果為DCM的臨床診斷提供了依據(jù)。