于水瀾，姜 穎，于英君，宋高臣

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院,黑龍江 哈爾濱150040;2.牡丹江醫(yī)學院,黑龍江 牡丹江157011)

研究發(fā)現(xiàn)，肝癌的發(fā)生是多因素、多基因相互作用的結(jié)果，與腫瘤相關(guān)的癌基因的過度表達或抑癌基因的表達缺失都會導致腫瘤的發(fā)生。目前除了傳統(tǒng)的化療、放療及手術(shù)治療外，靶向基因治療成為研究熱點[1]。腺相關(guān)病毒(AAV)具有感染范圍廣、免疫反應低、定點整合、攜帶的外源基因可持續(xù)穩(wěn)定表達等特點，目前已成為基因轉(zhuǎn)移最為理想的載體之一[2]。CDK2基因是細胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)家族的成員之一，在細胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)換過程中起著限速作用[3-5]。本實驗以此作為肝癌基因治療靶點，以AVV作為基因轉(zhuǎn)導載體[6-9]，構(gòu)建rAAV-shRNA-CDK2，希望能為肝癌基因治療提供新的理論依據(jù)和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

質(zhì)粒載體pAKD-shRNA、包裝質(zhì)粒 pAAV-RC 和輔助質(zhì)粒pHelper均購自上海艾博思生物科技有限公司(見圖1，圖2，圖3)；感受態(tài)細胞株DH5α，購自Takara公司；HEK-293細胞，購自上海艾博思生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1重組質(zhì)粒pAKD-shRNA-CDK2的構(gòu)建

利用KpnⅠ和BgIⅡ酶將質(zhì)粒載體按酶切反應體系進行酶切處理，產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將前期設計合成的針對靶基因的特異性siRNA序列上添加KpnⅠ(-GTAC-)和BgIⅡ(-GATC-)內(nèi)切酶的酶切位點序列與轉(zhuǎn)錄終止序列，合成完整的shDNA序列。經(jīng)退火反應后，形成兩端帶有KpnⅠ和BgIⅡ酶切位點的雙鏈寡核苷酸片段，標記為CDK2-shRNA。雙鏈DNA連接入酶切載體，取100 μl感受態(tài)細胞加入10 μl 連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化，根據(jù)CDK2-shRNA序列設計一對PCR引物：Primer(+):5′-ATTTGCATGTCGCTATGTGTTC-3′；Primer(-):5′-TAAAGGGAACAAAAGCTGGGTA-3′，進行菌落PCR鑒定及DNA測序。

圖1 質(zhì)粒載體pAKD-shRNA 圖2 包裝質(zhì)粒pAAV-RC 圖3 輔助質(zhì)粒pHelper

1.2.2重組腺相關(guān)病毒的包裝、純化

常規(guī)方法培養(yǎng)AAV-293細胞，觀察細胞生長情況，當細胞達到70-80%融合時采用AAV Helper Free系統(tǒng)將三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞，進行重組腺相關(guān)病毒的包裝。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，更換10 ml 新鮮的培養(yǎng)液放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，熒光倒置顯微鏡下觀察細胞中報告基因 EGFP 的表達情況，以便判斷是否共轉(zhuǎn)染成功。進一步對病毒進行收集、濃縮和純化。

1.2.3病毒載體滴度測定

對重組腺相關(guān)病毒rAAV-shRNA-CDK2采用定量PCR的方法進行滴度測定。將待測病毒樣品用DNase和RNase于37℃消化2-3 h，提取病毒DNA，沸水浴5 min使之變性，立即置于冰上2 min，將病毒樣品與標準品做倍比稀釋成不同濃度，進行定量PCR檢測，所用引物為：forward：5′-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3′，reverse：5′-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3′。PCR結(jié)束后，根據(jù)標準品繪制標準曲線，計算病毒樣品滴度，單位用v.g/ml來表示。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒載體的線性化

將質(zhì)粒載體利用Bgl II和KpnI酶進行酶切處理，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在大約6 943 bp處出現(xiàn)陽性條帶(見圖4)。

2.2 轉(zhuǎn)化菌質(zhì)粒鑒定

為了證明轉(zhuǎn)化菌質(zhì)粒含有正確序列的shDNA，我們挑取白色陽性克隆菌落進行PCR檢測。對結(jié)果進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析，第4、6泳道在大約174 bp處可見陽性條帶，與預期結(jié)果一致，表明此陽性菌落含有目的DNA片段，轉(zhuǎn)化成功(見圖5)。取6號轉(zhuǎn)化子進行DNA測序，測序引物為Primer(+)：5′-ATTTGCATGTCGCTATGTGTTC-3′。

2.3 重組載體序列測定分析

采用DNAStar的MegAlign軟件進行序列比對分析，結(jié)果證實所選送測序的堿基為正確序列的shDNA，寡核苷酸片段位于177位至241位(65個堿基)處 (見圖6)。

圖4 載體酶切圖譜

圖5 菌落PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

注：N，M分別為陰性對照組和Marker DL2000，第1-10泳道為轉(zhuǎn)化子樣本。

圖6 DNA測序報告

2.4 共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞的轉(zhuǎn)染效率

于三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞后48 h光鏡下觀察，細胞呈現(xiàn)不規(guī)則的多角形，貼壁狀態(tài)良好，胞漿透亮，胞核隱約可見(圖7)，在熒光顯微鏡下可以看到綠色熒光布滿整個細胞，分布較均勻(圖8)，提示轉(zhuǎn)染效率符合實驗要求。

圖7 自然光源下觀察 rAAV轉(zhuǎn)染48 h(200×) 圖8 熒光觀察rAAV轉(zhuǎn)染48 h(200×)

2.5 病毒滴度檢測

采用定量PCR方法進行滴度檢測，繪制標準曲線，，表明線性關(guān)系非常好(R2=0.999 4)，通過比對標準曲線計算病毒基因組拷貝數(shù)，其平均滴度為3.56×1012v.g/ml(見圖9)。

圖9 標準曲線

3 討論

近年來AAV由于其宿主細胞廣、能夠長期穩(wěn)定表達以及免疫原性低等優(yōu)勢已被廣泛應用于基因治療領域。本實驗利用AAV Helper Free系統(tǒng)進行病毒包裝，消除了活的輔助病毒及產(chǎn)生野生型AAV的危險，該系統(tǒng)是一個更安全、更方便，并且可以替代逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒的基因送遞系統(tǒng)，提高了我們實驗的生物安全級別[10,11]。

本研究采用Helper-Free系統(tǒng)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞的方法成功構(gòu)建rAAV載體[12,13]，獲得了能有效沉默人肝癌細胞CDK2基因表達的重組病毒rAAV-shRNA-CDK2。接下來我們將通過動物體內(nèi)注射將該病毒載體導入肝癌皮下移植瘤模型裸鼠，進一步研究與明確CDK2在肝癌細胞中的變化情況，并希望通過該研究能為肝癌的基因治療提供新的有效方法。