李炳彤，賈淑媛，李 萍

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，吉林 長(zhǎng)春130033)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，以持續(xù)性滑膜炎和關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的進(jìn)行性損傷為特征[1]。軟骨細(xì)胞與滑膜成纖維細(xì)胞(一種RA關(guān)節(jié)病變的主要效應(yīng)細(xì)胞[2])相互作用，同時(shí)軟骨細(xì)胞的存活狀態(tài)和細(xì)胞外基質(zhì)的代謝狀態(tài)直接影響關(guān)節(jié)功能[3]。脂聯(lián)素，也稱(chēng)為GBP28，apM1，Acrp30或AdipoQ，于1995年被發(fā)現(xiàn)，研究顯示其為脂肪細(xì)胞中高表達(dá)的蛋白質(zhì)[4-6]。脂聯(lián)素并不是一個(gè)同質(zhì)的單一體，而是由不同寡聚體的幾種亞型組成。低分子量(LMW)脂聯(lián)素，也稱(chēng)Trimeric脂聯(lián)素，由3個(gè)全長(zhǎng)脂聯(lián)素單體組成，中分子量(MMW)脂聯(lián)素，由2個(gè)三聚體結(jié)合形成的六聚體，高分子量(HMW)脂聯(lián)素，由三聚體形成的十二到十八聚體[7]。此外，不同脂聯(lián)素亞型在不同細(xì)胞中作用也不同[8，9]。研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，RA患者的血清和關(guān)節(jié)滑液中的脂聯(lián)素水平增加[10]，但脂聯(lián)素對(duì)RA病理生理的影響，尤其是對(duì)軟骨細(xì)胞的作用還不明確。因此，本研究旨在探討不同濃度和亞型的脂聯(lián)素與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細(xì)胞(RAC)產(chǎn)生炎癥因子之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

軟骨組織取自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的RA患者及行創(chuàng)傷修復(fù)的健康人。RA患者的診斷符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)修訂的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，健康人均排除風(fēng)濕性疾病。本研究獲得吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均同意將其組織細(xì)胞用于研究。在無(wú)菌條件下取關(guān)節(jié)表面的軟骨組織，剪碎后用胰酶和膠原酶消化。分離的軟骨細(xì)胞經(jīng)200目濾網(wǎng)過(guò)濾后，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 脂聯(lián)素刺激軟骨細(xì)胞

使用25 μg/ml、50 μg/ml和100 μg/ml濃度的HMW/MMW、Trimeric和Native脂聯(lián)素分別刺激RAC和人軟骨細(xì)胞(HC)，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)15小時(shí)，本研究刺激時(shí)間的選擇基于其他實(shí)驗(yàn)研究[11]。收集培養(yǎng)上清液，分裝后儲(chǔ)存于-20℃以便下一步分析。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的TNF-α、MMP-3以及MMP-10水平

收集培養(yǎng)體系的上清液，采用ELISA法檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3、MMP-10和腫瘤壞死因子(TNF)-α的濃度，其中MMP-10試劑盒購(gòu)自Abnova公司，MMP-3和TNF-α試劑盒購(gòu)自博士德公司，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格遵照說(shuō)明書(shū)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)與未刺激的RAC相比，不同濃度HMW/MMW、Trimeric和Native脂聯(lián)素均可刺激RAC分泌MMP-3、MMP-10和TNF-α增加。HMW/MMW脂聯(lián)素100 μg/ml與RAC共培養(yǎng)后，其分泌MMP-3的濃度增加至19.54倍，而MMP-10和TNF-α的濃度也較基礎(chǔ)濃度升高，相應(yīng)增加至1.74倍和1.54倍。應(yīng)用100 μg/ml濃度的Trimeric脂聯(lián)素刺激RAC后，MMP-3、MMP-10和TNF-α的濃度均較基礎(chǔ)濃度升高，相應(yīng)增加至7.10倍、1.07倍和1.22倍。應(yīng)用100 μg/ml濃度的Native脂聯(lián)素刺激RAC后，MMP-3、MMP-10和TNF-α的濃度增加至13.74倍、1.49倍和1.36倍。三種脂聯(lián)素刺激RAC分泌炎癥因子的水平升高，與未刺激RAC和相同濃度脂聯(lián)素刺激的HC相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(如表1)。

表1 三種脂聯(lián)素亞型刺激RAC分泌炎癥因子的差異

p1表示與僅用培養(yǎng)液培養(yǎng)的RAC相比較；p2表示與相同條件下HC相比較。MMP,基質(zhì)金屬蛋白酶;TNF,腫瘤壞死因子;RAC,類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細(xì)胞;HC,健康人的軟骨細(xì)胞。

進(jìn)一步分析了不同濃度(25 μg/ml、50 μg/ml和100 μg/ml)的3種不同亞型脂聯(lián)素對(duì)RAC和HC分泌MMP-3、MMP-10和TNF-α的作用程度，結(jié)果如圖1。3種脂聯(lián)素對(duì)RAC和HC分泌炎癥因子的作用均隨濃度增加而增大。在3種脂聯(lián)素中，HMW/MMW亞型脂聯(lián)素作用最強(qiáng)，Native脂聯(lián)素作用次之，而Trimeric亞型脂聯(lián)素作用最弱，且三者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 濃度遞增脂聯(lián)素亞型對(duì)RAC和HC的刺激作用

* 表示與Native和Trimeric脂聯(lián)素相比，P<0.01。MMP,基質(zhì)金屬蛋白酶;TNF,腫瘤壞死因子;RAC,類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細(xì)胞;HC,健康人的軟骨細(xì)胞。

3 討論

近年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注脂肪因子在自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展中的重要作用。有學(xué)者已證實(shí)脂肪因子可作用于關(guān)節(jié)軟骨、滑膜阻止以及T、B淋巴細(xì)胞[12]。脂聯(lián)素是脂肪因子的一種類(lèi)型，已有多篇文獻(xiàn)證實(shí)在RA的脂聯(lián)素在RA病情進(jìn)展中起促炎作用[13，14]，另外，也有研究表明，與骨關(guān)節(jié)炎相比，RA患者血清和關(guān)節(jié)液的脂聯(lián)素的水平明顯升高[10，15]。經(jīng)過(guò)我們的前期研究，還發(fā)現(xiàn)RA患者血清中不同脂聯(lián)素亞型的表達(dá)水平不相同，且各亞型脂聯(lián)素水平均明顯高于健康人[16]。這些研究結(jié)果均提示脂聯(lián)素對(duì)RA發(fā)生發(fā)展起重要作用，但針對(duì)不同濃度脂聯(lián)素亞型對(duì)RAC影響的研究較少。本文主要探討不同濃度和亞型的脂聯(lián)素與RAC分泌炎癥因子的關(guān)系，并選取MMP-3、MMP-10和TNF-α 3種與RA病理機(jī)制密切相關(guān)的炎癥因子重點(diǎn)研究。

RA的重要病理改變是關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞，進(jìn)一步導(dǎo)致患者殘疾并影響患者生活質(zhì)量，而MMPs(如MMP-3和MMP-10)，在關(guān)節(jié)軟骨及骨破壞過(guò)程中發(fā)揮重要作用[17]。MMPs在正常組織中的表達(dá)極其微弱，而在病變組織中異常升高[15]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMW/MMW、Trimeric和Native三種脂聯(lián)素亞型均可刺激RAC表達(dá)MMP-3和MMP-10，并且這種刺激作用隨濃度升高而增大，同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)HMW/MMW亞型脂聯(lián)素的刺激作用最強(qiáng)，也就是說(shuō)，HMW/MMW亞型脂聯(lián)素的可能在促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的破壞發(fā)揮了重要作用。

已有大量文獻(xiàn)證實(shí)，在多種自身免疫病(特別是RA)的發(fā)生發(fā)展中TNF-α發(fā)揮了重要的促炎作用[18]，但脂聯(lián)素在TNF-α表達(dá)過(guò)程中是發(fā)揮促炎還是抑炎作用，目前尚無(wú)定論。Ehling研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素并不影響類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞表達(dá)TNF-α和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的水平[11]。但是，Lee等研究表明脂聯(lián)素能夠誘導(dǎo)炎癥關(guān)節(jié)的成骨細(xì)胞分泌MMP-1、MMP-13、VEGF、白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-8[19]。值得注意的是，上述研究均使用Native脂聯(lián)素，而未對(duì)不同亞型脂聯(lián)素的作用差異進(jìn)行深入探討。本研究發(fā)現(xiàn)HMW/MMW、Trimeric和Native脂聯(lián)素均能濃度依賴(lài)性地升高RAC中TNF-α的水平，并且HMW/MMW亞型脂聯(lián)素的作用最強(qiáng)，表明不同脂聯(lián)素亞型可能通過(guò)升高TNF-α對(duì)RA關(guān)節(jié)炎癥及關(guān)節(jié)破壞發(fā)揮作用。

綜上所述，HMW/MMW、Trimeric和Native脂聯(lián)素亞型均可通過(guò)促進(jìn)RAC中MMP-3、MMP-10和TNF-α的分泌進(jìn)而發(fā)揮促炎作用，其中HMW/MMW脂聯(lián)素作用最強(qiáng)。因此，HMW/MMW脂聯(lián)素可能在RA關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)破壞和血管翳形成的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。盡可能降低關(guān)節(jié)內(nèi)脂聯(lián)素的水平，特別是HMW/MMW亞型，可能是治療RA的新方法。