周 琪,張海萍,閆金銀

(唐山市人民醫(yī)院 乳腺外科，河北 唐山063000)

乳腺癌已成為世界范圍內女性最常見的惡性腫瘤之一,也是引起女性死亡的重要病因。乳腺癌的總體發(fā)病率及年齡特異性發(fā)病率均呈上升趨勢，解決這一醫(yī)療難題顯得日益迫切和嚴峻。

近年來，從傳統中藥和天然植物中提取防治腫瘤的有效成分已成為治療腫瘤的希望和新途徑。蒜素是大蒜中主要生物活性成分的總稱，為多種烯丙基有機硫化合物復合體，近些年研究證實，其具有抗菌消炎，提高免疫力，抗腫瘤等多重作用。但作為有機硫化物的混合物，蒜素由于其穩(wěn)定性差，易揮發(fā)，不穩(wěn)定，易分解，并具有獨特的臭味和刺激性，很難在臨床上開展應用。S-烯丙基巰基半胱氨酸(SAMC)是水溶性有機硫化物，是蒜素的主要生物活性成分，為白色無味，擁有較高的生物利用度和穩(wěn)定性，其制備可從蒜素中提取，也可通過化學方法合成。相關研究證實，SAMC可以直接抑制體外培養(yǎng)的結腸癌、肺癌、乳腺和胃癌細胞的增殖。但在動物模型中，對乳腺癌腫瘤的直接抑制及其作用機制卻較少見研究。本實驗重點觀察SAMC對乳腺癌細胞NF-κB及MAPK細胞信號傳導通路的影響來確定SAMC的抗乳腺癌機制。為今后應用SAMC治療乳腺癌提供理論基礎與實驗依據，進一步為乳腺癌的治療提供新的途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 材料和主要儀器

人乳腺癌細胞系MCF-7，購自于深圳百恩維生物科技有限公司。SAMC(北京世紀奧科生物技術有限公司)。Balb/c nude裸鼠，雌性。購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。4周齡，體重170-200 g，無特殊病原體環(huán)境(spcific-pathogen free，SPF)飼養(yǎng)。SP免疫組化超敏檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒購自福州邁新公司。p-p38 抗體，IKK-β抗體(美國Cell Signaling Technology 公司)。

1.2 方法

1.2.1乳腺癌裸鼠模型的建立 常規(guī)方法復蘇MCF-7細胞株，加入DMEM培養(yǎng)液。放入37℃含5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。收集處于對數生長期的細胞,經磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后制成濃度為1×106/ml的細胞懸液，接種于裸鼠皮下(0.2 ml/只)。1周后選造模成功的裸鼠30只實驗待用。

1.2.2實驗分組及標本采集 將種瘤成功的裸鼠稱重后，將30只裸鼠應用隨機數字表分為3組，每組10只，即對照組(腹腔注射生理鹽水 0.2 ml)、SAMC低濃度組(腹腔注射SAMC150 mg/kg)、SAMC高濃度組(腹腔注射SAMC 250 mg/kg)每周給藥5次，共治療3周。治療期間,每天觀察裸鼠狀況，每4天使用精度為0.1 mm的游標卡尺分別測量對照組、SAMC低濃度組、SAMC高濃度組裸鼠腫瘤的最大徑和最小徑，于首次給藥后第21天脫頸處死全部裸鼠。

切取各組裸鼠的腫瘤組織,并稱量瘤重，計算各鼠抑瘤率，IR=(1-瘤重/對照組瘤重平均值)×100%；同時測量瘤體的最大徑和最小徑，并根據公式：體積=最小徑×最小徑×最大徑×0.5，計算出瘤體積。切取適量瘤組織置于-80℃冰箱中冷藏待用。其余瘤組織以10%多聚甲醛固定72 h后,石蠟包埋,以備后用。

1.3 免疫組化法檢測p-p38MAPK 及 IKK-β表達

組織切片標本常規(guī)脫蠟、水化，3% H2O2孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗5 min×3 次，分別滴加一抗p-p38 抗體，IKK-β抗體，4 ℃過夜。PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗 羊抗兔IgG抗體，室溫孵育60 min。PBS沖洗5min×3次，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，室溫孵育20 min。DAB顯色，自來水沖洗、蘇木素復染、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。400倍光鏡下，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對免疫組化結果進行定量分析，分別測量各組的平均光密度值。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 SAMC對乳腺癌荷瘤鼠腫瘤體積的影響

為了明確各組腫瘤的生長變化情況，本實驗分別于給藥第1，5，9，13，17，21天測量對照組、低濃度組、高濃度組裸鼠荷瘤的長徑和短徑，并計算每組裸鼠腫瘤體積，見表1。由其體積變化可知，SAMC明顯抑制了腫瘤的生長，這種差別隨著治療的繼續(xù)而變得越加明顯。

2.2 SAMC對乳腺癌荷瘤鼠腫瘤生長的影響

稱取瘤重后，SAMC兩組與對照組之間均有顯著差異(P<0.001)，高、低濃度SAMC組間有顯著差異(P<0.001)。低濃度組和高濃度組抑瘤率分別為36.8±11.41%和51.91±5.13%，具有統計學差異(P=0.002)，見表2。

2.3 免疫組化法檢測相關蛋白結果

免疫組化結果顯示，p-p38MAPK蛋白陽性表達位于癌細胞的胞核，部分位于胞質。而IKK-β蛋白陽性表達主要位于癌細胞的胞質中。見圖1。

表1 治療中各組腫瘤體積的變化

注：經重復測量方差分析，不同時間點體積變化差別有統計學意義(F組內=843.474，P<0.001)；不同組間研究對象體積差別有統計學意義(F組間=49.071，P<0.001)，時間和組別對體積變化的交互作用有統計學意義(F交互=60.542，P<0.001)

表2 治療結束后各組腫瘤生長的情況

使用Image-Pro Plus軟件檢測平均光密度值。p-p38MAPK對照組為0.10±0.01；低濃度組為0.19±0.02；高濃度組為0.36±0.04。IKK-β對照組為0.47±0.05；低濃度組為0.21±0.02；高濃度組為0.13±0.01。

圖1 各組裸鼠乳腺癌免疫組化情況

與對照組相比，低濃度組和高濃度組的p-p38MAPK表達明顯增高，差異具有顯著性(P<0.001)。同時該蛋白在高濃度組中的表達要強于低濃度組，差異具有顯著性(P<0.001)，與對照組相比，低濃度組和高濃度組的IKK-β表達明顯降低，差異具有顯著性(P<0.001)。同時該蛋白在低濃度組中的表達要強于高濃度組，差異具有顯著性(P<0.001)。見表3。

3 討論

蒜素可以通過調節(jié)致癌物的代謝、阻滯腫瘤細胞周期、誘導腫瘤細胞凋亡、抗氧化和提高機體免疫力等途徑抑制動物體內的腫瘤生長，同時，聯合應用還能提高化療藥物的治療作用。但由于其化學穩(wěn)定性差，容易被分解，進入人體后易被代謝，清除，導致其在某些體內試驗及臨床試驗，不能提供完美的抗癌證據[1]。SAMC，提純自蒜素，但擁有較高的生物利用度和穩(wěn)定性，對于其是否具有應用于實體瘤臨床治療的潛能，人們已經相繼開展了一些體外的研究工作。本研究中，我們發(fā)現SAMC可以通過影響p38MAPK及IKK/NF-κB細胞信號傳導通路,使移植至裸鼠的乳腺癌體積縮小，起到抗腫瘤的作用。

表3 p-p38MAPK、IKK-β在各組移植瘤中的表達量

注：與對照組比較，aP<0.001;與低濃度組比較，bP<0.001

本實驗證實，SAMC對裸鼠移植乳腺癌腫瘤的生長有抑制作用。對照組瘤體積為：(507.47±75.88)mm3；SAMC低濃度組瘤體積為：(369.8±30.36)mm3；SAMC高濃度組瘤體積為(241.95±35.84)mm3。對照組瘤重為(0.46±0.04)g；SAMC低濃度組瘤重為(0.31±0.02)g；SAMC高濃度組瘤重為(0.22±0.03)g。SAMC低濃度組抑瘤率為(36.8±11.41)%，SAMC高濃度組率為(51.91±5.13)%。無論是瘤體積、瘤重還是抑瘤率，SAMC兩組與對照組之間均有顯著差異。說明SAMC的確抑制了乳腺癌腫瘤的生長。

P38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的重要成員，多種細胞外因子可使其磷酸化后而被激活?；罨蟮膒38MAPK(p-p38MAPK)可通過多種方式影響細胞的增殖，分化，遷移及凋亡。SAMC可以通過JNK和P38MAPK途徑阻止人腸癌細胞SW620的增殖并誘導其凋亡[2]。有報道大蒜提取物DATS抑制裸鼠移植乳腺癌腫瘤的生長，并通過體外細胞學試驗發(fā)現DATS處理后的SGC-7901細胞中p-p38MAPK蛋白量增加[3]。本研究直接利用裸鼠移植瘤模型，在實體瘤中發(fā)現，低濃度組及高濃度組中p-p38MAPK 蛋白量明顯高于對照組，這說明SAMC可激活p38MAPK，進而通過MAPK信號轉導途徑產生抑瘤作用。

對于蒜素通過NF-κB信號轉導途徑影響腫瘤細胞的研究并不少見[4,5]。有報道利用亞硝基二乙胺(NDEA)建立了大鼠的肝癌模型，并使用蒜素油治療[6]。結果顯示，NDEA可降低IκB的表達水平和促進NF-κB p65磷酸化，誘導肝癌的產生，但加用蒜素油之后，可明顯逆轉NDEA的這種作用。作為調控細胞增殖、分化和凋亡的重要信號通路，NF-κB途徑的調控機制研究一直是該領域的熱點內容[7]。但研究方向多在NF-κB的核轉位，及IKK復合體酶活性方面，本研究發(fā)現SAMC可以直接調節(jié)IKK-β的表達水平，還屬鮮見。而對于SAMC對NF-κB核轉位的影響我們也將在后繼試驗中展開。

綜上所述，本實驗成功的建立了乳腺癌裸鼠模型，使用不同濃度的SAMC抑制了乳腺癌腫瘤的生長。通過免疫組化法，檢測到腫瘤細胞p-p38MAPK蛋白量增加，同時IKK-β蛋白量降低，說明SAMC可能通過MAPK以及NF-κB兩條途徑對乳腺癌細胞產生抑制作用，為乳腺癌的治療提供了新的途徑。