冉貴萍 ，陳 英，謝艷平，李 娜，袁 勇，杜翠紅，郭 鵬

(上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院奉城分院,上海201411)

子癇前期(Preeclampsia,PE)是臨床產(chǎn)科常見并發(fā)癥，會(huì)影響母嬰生命安全。及早發(fā)現(xiàn)并采取積極有效的干預(yù)措施，可延遲子癇發(fā)生，改善妊娠結(jié)局，但子癇前期早期癥狀并無明顯特異性，一經(jīng)檢出，母嬰已受到不同程度損傷。因此，在PE臨床癥狀出現(xiàn)前進(jìn)行早期預(yù)測(cè)對(duì)降低孕產(chǎn)婦與圍產(chǎn)兒病死率、提高母嬰健康具有重要意義[1]。傳統(tǒng)的檢測(cè)指標(biāo)如尿蛋白、凝血功能參數(shù)等指標(biāo)在早期預(yù)測(cè)PE存在局限性，因此尋找靈敏度高特異性好的指標(biāo)進(jìn)行早期預(yù)測(cè)是臨床亟待解決的問題。胎兒游離DNA(Cell free fetal DNA,cffDNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種特異性的無創(chuàng)性生物學(xué)標(biāo)記物，越來越多研究發(fā)現(xiàn)其在各種病理性妊娠早期階段會(huì)出現(xiàn)含量的變化，如流產(chǎn)[2]、侵入性胎盤[3]等，但對(duì)于子癇前期的預(yù)測(cè)診斷價(jià)值的研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用熒光定量PCR的方法，檢測(cè)孕婦外周血中高甲基化RASSF1A基因的含量，分析子癇前期孕婦與正常妊娠孕婦外周血中游離胎兒DNA的含量變化，探討其對(duì)子癇前期的預(yù)測(cè)診斷價(jià)值，本研究的目的是通過檢測(cè)孕婦血漿中高甲基化RASSF1A基因濃度來預(yù)測(cè)孕婦是否會(huì)發(fā)生子癇前期及判斷嚴(yán)重程度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象收集2015年6月到2017年10月奉城醫(yī)院產(chǎn)前診斷門診的子癇前期患者32例，年齡為31.48±4.84歲(26-38歲)，包括子癇前期輕度患者22例，平均孕周36.48±3.02周，子癇前期重度患者10例，平均孕周36.78±2.83周。入組標(biāo)準(zhǔn)：子癇前期臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)參照人衛(wèi)第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》[4]教材，本次妊娠單胎妊娠，既往無不良妊娠史，無內(nèi)外科疾病，無腫瘤相關(guān)疾??；另取同期孕齡健康妊娠孕婦30例作為健康對(duì)照組，年齡在30.63±4.16歲(24-38歲)，平均孕周為36.89±2.62周；兩組孕婦的年齡、孕周均無顯著性差異(P>0.05)。另收集門診體檢的健康未妊娠女性外周血血漿標(biāo)本2例作為陰性對(duì)照。

1.2 主要試劑與儀器血漿DNA提取試劑：寧波有成生物醫(yī)藥科技有限公司的微量血漿游離DNA提取試劑盒；熒光定量PCR體系：TAKARA寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；BstUI酶：New England Biolabs Inc.(NEB美國)；人基因組定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：上海甄準(zhǔn)生物技術(shù)有限公司；熒光量PCR儀：美國ABI公司ABI7500定量PCR儀。

1.3 方法

1.3.1血漿DNA的提取 提取步驟較試劑盒說明書稍作改良,由200 μl血漿標(biāo)本增加到400 μl血漿,相應(yīng)的試劑也進(jìn)行了增倍處理，提取的DNA溶于50 μl的溶解液中,-20℃貯存。

1.3.2酶切處理 提取到的DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶BstUI處理[5]。構(gòu)建酶切體系25 μl：模板DNA 20 μl、BstUI酶1 μl(10U)、buffer 2.5 μl加滅菌水至25 μl，60℃水浴16 h。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系[6]：將酶切后的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，體系為20 μl：SYBR Green I 10 μl，酶切后的DNA模板8 μl，引物各1 μl。同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參基因ACTB和對(duì)照組。擴(kuò)增條件為：50℃溫育2 min；95℃預(yù)變性3 min；然后再95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。RASSF1A基因正向引物[7]：5′-AGCCGTAGCTCATTGAGCTG-3′，反向引物：5′-ACCAGCTGCCGTGTGG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為130 bp；ACTB基因正向引物：5′-GCGCCGTTCCGAAAGTT-3′，反向引物:5′-CGGCGGATCGGCAAA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為137 bp；所有引物由TAKARA公司合成。

1.3.4定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 采用已知濃度的胎兒基因組DNA(3.8×104copies/μL)用去離子水倍比稀釋成3個(gè)濃度：3.8×103copies/μL、3.8×102copies/μL、38copies/μL， 在PCR體系中每個(gè)濃度加入8 μl。孕婦血漿胎兒DNA濃度可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可得出[6]。每份樣本做2個(gè)平行管,計(jì)算均值濃度,同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和空白對(duì)照。

1.3.5統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS18.0和Graphpad Prism統(tǒng)計(jì)軟件，DNA濃度為非參數(shù)數(shù)據(jù)，以中位數(shù)表示。兩組間比較采用秩和檢驗(yàn)。ROC曲線、靈敏度、特異度用來評(píng)估孕婦血漿高甲基化RASSF1A水平對(duì)子癇前期的預(yù)測(cè)價(jià)值，統(tǒng)計(jì)結(jié)果P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同研究組孕婦臨床參數(shù)比較

從表1看出，子癇前期組和健康對(duì)照組孕婦年齡、采血孕周相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，子癇前期組的孕婦體質(zhì)量指數(shù)(BMI)較高，較多的孕婦有流產(chǎn)史、高血壓家族史，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表1 不同研究組孕婦臨床參數(shù)特性

2.2 不同研究組孕婦血漿高甲基化RASSF1A水平的比較

從表2看出，輕度和重度子癇前期組孕婦血漿高甲基化RASSF1A水平均顯著高于健康對(duì)照組(P<0.01)，且重度子癇前期組孕婦高甲基化RASSF1A水平高于輕度子癇前期組孕婦高甲基化RASSF1A水平。

2.3 評(píng)價(jià)孕婦血漿高甲基化RASSF1A基因檢測(cè)對(duì)子癇前期的預(yù)測(cè)診斷價(jià)值

見圖1。孕婦血漿高甲基化RASSF1A中位數(shù)倍值MoMs預(yù)測(cè)輕度子癇前期AUC面積為0.84，cutoff值為1.71時(shí)，敏感性為86.4%，特異性為71.2%；預(yù)測(cè)重度子癇前期AUC面積為0.96，cutoff值為2.21時(shí)，敏感度為90.0%，特異度為87.1%。

表2 不同研究組孕婦血漿高甲基化RASSF1A水平

圖1 RASSF1A基因預(yù)測(cè)輕度和重度子癇前期的ROC曲線

3 討論

孕婦血漿中游離胎兒DNA(Cell-free fetal DNA,cffDNA)是無創(chuàng)產(chǎn)前診斷較為理想的生物標(biāo)記物[8,9]，其主要由來自胎兒細(xì)胞的DNA和來自胎盤組織的胎兒DNA構(gòu)成。胎盤組織損傷或胎盤細(xì)胞凋亡后細(xì)胞DNA會(huì)釋放進(jìn)入母體循環(huán)，這就為cffDNA 成為潛在的子癇前期早期預(yù)測(cè)的生物學(xué)指標(biāo)提供了理論依據(jù)。本研究中采用高甲基化RASSF1A濃度代表胎兒DNA的水平[10]，因?yàn)檠獫{中存在的DNA包括母體循環(huán)游離DNA和胎兒循環(huán)游離DNA，兩者之間存在甲基化差異，即胎兒DNA為高甲基化狀態(tài)，而母體DNA為低甲基化狀態(tài)，經(jīng)BstUI內(nèi)切酶處理后，低甲基化的母體DNA被消化而保留高甲基化的胎兒DNA，由此本研究中檢測(cè)的高甲基化RASSF1A可以代表胎兒DNA水平。

本實(shí)驗(yàn)研究中測(cè)得22例輕度子癇前期組血漿高甲基化RASSF1A基因濃度是795copies/mL，中位數(shù)倍值是正常對(duì)照組孕婦的血漿高甲基化RASSF1A的3.28倍，10例重度子癇前期孕婦血漿高甲基化RASSF1A基因濃度是2640copies/mL，中位數(shù)倍值是正常對(duì)照組孕婦的10.47倍，提示孕婦血漿高甲基化RASSF1A基因水平在子癇前期會(huì)增高，且與嚴(yán)重程度相關(guān)。近年來國外也有cffDNA與PE的相關(guān)性研究，YU等[11]對(duì)20名早發(fā)性PE孕婦血漿檢測(cè)了SRY基因，cffDNA水平LOG中位值為3.08,顯著高于健康對(duì)照者1.79；Sifakis等[12]對(duì)44名早發(fā)性PE孕婦血漿DNA檢測(cè)DYS14序列，cffDNA水平中位值為95.5GE/mL顯著高于健康妊娠對(duì)照者51.5GE/mL，且增高水平與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)；因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。本實(shí)驗(yàn)選用的RASSF1A基因，較既往研究中采用的SRY基因、DYS14序列，可以不僅僅局限于男胎，臨床檢測(cè)中可作為胎兒的通用標(biāo)記物。本實(shí)驗(yàn)研究中將所有孕婦血漿中的高甲基化RASSF1A基因含量轉(zhuǎn)化成中位數(shù)倍值(MoMs)，消除了孕周對(duì)cffDNA 水平的影響。PE孕婦的cffDNA水平增高，可能與PE的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，目前學(xué)界普遍認(rèn)為PE為胎盤源性疾病，滋養(yǎng)層侵襲異?；蛱ケP淺著床致使胎盤缺血缺氧，胎盤細(xì)胞凋亡增加，cffDNA的釋放增加；隨著病情進(jìn)展，胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)一步缺少血液供應(yīng)和氧氣供應(yīng)，誘發(fā)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡加重，最終使得血循環(huán)中cffDNA急劇升高。

本實(shí)驗(yàn)研究中采用ROC曲線分析孕婦血漿cffDNA水平對(duì)子癇前期的診斷價(jià)值，當(dāng)cutoff值為2.21時(shí)，對(duì)重度子癇前期診斷的敏感度可達(dá)到90.0%，特異度為87.1%，提示孕婦血漿高甲基化RASSF1A水平預(yù)測(cè)子癇前期具有一定臨床意義。目前，臨床上有較多的子癇前期的預(yù)測(cè)指標(biāo)，如：子宮動(dòng)脈多普勒、纖連蛋白、血清胎盤生長(zhǎng)因子(PLGF)和妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPPA)[13]等，這些指標(biāo)的特異度較好均超過90%，但靈敏度較低，只有子宮動(dòng)脈阻力指數(shù)和結(jié)合指數(shù)的敏感度超過60%，尿激肽釋放酶等檢查項(xiàng)目，在不考慮特異度的情況下敏感度能達(dá)到80%。因此孕婦血漿cffDNA較傳統(tǒng)檢測(cè)指標(biāo)具有較好的靈敏度和特異性，在妊娠早期未出現(xiàn)臨床癥狀前能對(duì)PE進(jìn)行有效的預(yù)測(cè)，是一項(xiàng)有潛力的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。但是任何一項(xiàng)單一的檢測(cè)指標(biāo)對(duì)于預(yù)測(cè)子癇前期都具有局限性，多項(xiàng)指標(biāo)的聯(lián)合使用能極大地提高靈敏度和特異度，因此，聯(lián)合檢測(cè)cffDNA和其他的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的研究，將是我們今后的研究工作開展方向。

總之，子癇前期孕婦血漿游離胎兒DNA水平較高，且隨著病情的加重而不斷升高，早期檢測(cè)孕婦血漿高甲基化RASSF1A基因可作為判斷評(píng)估子癇前期及其病情嚴(yán)重程度的潛在有效指標(biāo)，對(duì)判斷及阻止患者不良妊娠結(jié)局的發(fā)生具有重要意義。