桑 平,李高峰,李雪鵬,張季鎧

(吉林省人民醫(yī)院 骨科,吉林 長春130021)

關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是最常見的骨骼肌肉疾病，是一種危害成人健康的慢性漸進性疾病，是與年齡相關(guān)的、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成與分解代謝失衡造成的骨關(guān)節(jié)疾病[1]。其病理特點是關(guān)節(jié)軟骨的破壞，細(xì)胞外基質(zhì)的減少，軟骨下骨的改變及關(guān)節(jié)的炎癥改變。關(guān)節(jié)的炎癥影響和參與已被廣泛認(rèn)可，這種自身炎癥反應(yīng)引起分解代謝旺盛及軟骨細(xì)胞凋亡，最終引起關(guān)節(jié)軟骨的降解，引起一系列的臨床癥狀，其中前列腺素E2在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中具有重要作用[2]，參與前列腺素E2的三種酶分別為：磷脂酶A2、膠原酶及前列腺素合酶，雖然病因已經(jīng)明確，但是仍沒有有效率的預(yù)防和治療手段[3,4]?；蛐酒夹g(shù)作為高通量、高敏感基因組學(xué)的研究技術(shù)，目前已被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，它通過成千上萬個探針點結(jié)構(gòu)，攝取細(xì)胞或組織標(biāo)本的mRNA表達(dá)水平，然后通過對不同生理病理條件下提取的mRNA的表達(dá)進行平行比較，可在更深層次上認(rèn)識器官的病理或生理現(xiàn)象。Affymetrix的體系及系統(tǒng)是國際上應(yīng)用最多和技術(shù)成熟的平臺，它提出了基因標(biāo)準(zhǔn)化的概念，實現(xiàn)了數(shù)據(jù)的共享性、客觀性和可比性[5]。基因芯片技術(shù)對于軟骨代謝失衡的分子機制的進一步明確，將能使關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防及治療得到改善。致病的相關(guān)的基因其中大量基因為細(xì)胞因子所介導(dǎo)或者炎性介質(zhì)基因，基因芯片技術(shù)為該病的分子遺傳學(xué)研究提供了新的思路[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

標(biāo)本來源及分組：收集9例關(guān)節(jié)軟骨組織樣本，其中正常膝關(guān)節(jié)軟骨樣本3例來自我院創(chuàng)傷骨科因暴力碾挫傷而行截肢手術(shù)的患者股骨髁軟骨組織，6例來源于髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)置換手術(shù)患者軟骨樣本,患者均參照ACR髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)選擇，患者平均年齡為54歲。

1.2 方法

將采集的軟骨細(xì)胞進行體外培養(yǎng)、刺激及鑒定，-75℃冰箱凍存。然后行基因表達(dá)譜芯片檢測程序，首先Trizol法行總RNA提取、質(zhì)量檢測及純化，體外轉(zhuǎn)錄(IVT)cRNA合成及隨機引物反轉(zhuǎn)錄，樣品標(biāo)記和雜交Realtime-PCR反應(yīng)及ELISA檢測，流程結(jié)束后，離心并將芯片洗滌和準(zhǔn)備掃描。

1.3 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計學(xué)方法

采用Affymetrix Gene Human Genome U133 Plus 2.0 Array軟件及Affymetrix miRNA v2.0芯片技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用進行RMA分析，對炎癥狀態(tài)下?lián)p傷細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞的組基因及miRNA表達(dá)譜進行構(gòu)建并進行信息學(xué)分析，包括背景校正，將探針信號過濾整合為probeset信號等，取得分析報告數(shù)據(jù)。使用信號比值方法進行Ratiocompare比較分析，計算兩組間基因譜表達(dá)差異的顯著性水平(P值)和誤判率,從而得到差異基因，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及總RNA質(zhì)檢結(jié)果

體外分離培養(yǎng)活躍的軟骨細(xì)胞(圖1)，所有正常對照組、炎性對照組、藥物干預(yù)組的軟骨細(xì)胞經(jīng)裂解后行RNA質(zhì)檢。使用SMA3000分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢實驗，檢測RNA的濃度、純度及完整性，質(zhì)控證實已經(jīng)提取到高純度的總RNA。

圖1 正常狀態(tài)下活躍的軟骨細(xì)胞

2.2 炎癥介質(zhì)白細(xì)胞介素18刺激可引起軟骨細(xì)胞炎癥合成通路的基因表達(dá)譜異常表達(dá)

白細(xì)胞介素包括促炎性和抑制炎性的白細(xì)胞介素，其中促進炎癥白細(xì)胞介素18在骨性關(guān)節(jié)炎病理生理過程中是關(guān)鍵因素，為了驗證白細(xì)胞介素18對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥合成通路基因表達(dá)譜的影響，我們分別將培養(yǎng)板設(shè)為正常對照組、炎性對照組(白細(xì)胞介素18刺激組)并對之行芯片檢測。炎性對照組與正常對照組相比，基因表達(dá)及細(xì)胞信號合成通路存在明顯表達(dá)異常(圖2)。其中與前列腺素E2及磷脂酶A2、膠原酶代謝有關(guān)的基因為：ACAN、COL2A1、PTGES、PTGS2、IL1a、IL6、IL17等基因均上調(diào)； MMP、MEZ及IFN等基質(zhì)降解酶類基因上調(diào)。本組實驗表明白細(xì)胞介素18能夠增加前列腺素E2信號合成通路關(guān)鍵酶基因表達(dá)，同時激活絲裂原活化蛋白激酶信號通路，有效的促進炎癥的發(fā)生及軟骨組織的降解。

2.3 硫酸氨基葡萄糖對骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞反應(yīng)通路基因表達(dá)譜的影響

圖2 表達(dá)上調(diào)的基因，橫軸為炎性對照組/正常對照組基因表達(dá)的比值

為了驗證硫酸氨基葡萄糖對骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥合成通路基因表達(dá)譜的影響，我們將培養(yǎng)板分別設(shè)為炎性對照組(白細(xì)胞介素18刺激組)、藥物干預(yù)組(硫酸氨基葡萄糖+白細(xì)胞介素18)，分別提取軟骨細(xì)胞進行基因芯片檢測。與炎性對照組相比，藥物干預(yù)組基因表達(dá)及細(xì)胞信號合成通路存在明顯表達(dá)異常。其中ACAN、COL2A1、PTGES、PTGS2、IL1a、IL6、IL17等與前列腺素E2、磷脂酶A2及膠原酶炎癥有關(guān)的基因基因下調(diào)；IL4、 IL10、 IL24、PTGS1抑制炎性基因上調(diào)；CXCL13、TNFRSF9、TNFSF10、VEGFA等誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因下調(diào)；抑制凋亡基因ADATm-4、BCL2、FGF18、TRAF1等基因上調(diào)。本實驗證明硫酸氨基葡萄糖能夠抑制骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞前列腺素E2合成通路關(guān)鍵酶膠原酶和磷脂酶A2基因的表達(dá)，減少前列腺素E2生成，同時抑制絲裂原活化蛋白激酶信號通路，從而控制炎癥的發(fā)生及軟骨細(xì)胞的降解。

3 討論

骨性關(guān)節(jié)炎是一種逐漸喪失關(guān)節(jié)功能和肢體活動能力從而降低生活質(zhì)量的退行性疾病，其發(fā)生、發(fā)展是一個多階段過程，其病理特點是關(guān)節(jié)軟骨的破壞，細(xì)胞外基質(zhì)的減少，軟骨下骨的退變及關(guān)節(jié)的炎癥改變。但是還沒有有效的預(yù)防及治療手段，許多易感因素會造成膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生及進展，它是一個與年齡相關(guān)的、軟骨基質(zhì)降解與修復(fù)失衡而產(chǎn)生的疾病[7]，并由炎癥及應(yīng)壓力加速病變的發(fā)展[8]，關(guān)節(jié)的炎癥影響和參與已被廣泛認(rèn)可，這種自身炎癥反應(yīng)引起分解代謝旺盛及軟骨細(xì)胞凋亡，最終引起關(guān)節(jié)軟骨的降解，引起一系列的臨床癥狀，前列腺素E2是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種脂肪酸代謝產(chǎn)物，在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中具有重要作用[9]，參與前列腺素E2生成的主要二種酶分別為：磷脂酶A2及膠原酶。關(guān)節(jié)炎癥狀態(tài)下，白細(xì)胞介素18能夠增加前列腺素E2信號合成通路關(guān)鍵酶基因表達(dá)，同時激活絲裂原活化蛋白激酶信號通路，有效的促進炎癥的發(fā)生及軟骨組織的降解。膠原酶和磷脂酶A2由各種細(xì)胞因子、介質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生于炎癥反應(yīng)具有重要作用。使用硫酸氨基葡萄糖治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎，作用機制是能夠調(diào)控減輕炎性反應(yīng)、減少細(xì)胞外基質(zhì)降解、降低關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡及改善穩(wěn)定軟骨細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的作用。實驗表明硫酸氨基葡萄糖不僅可以抑制膠原酶和磷脂酶A2的活性，同時也可以減少膠原酶和磷脂酶A2基因的表達(dá)，從而達(dá)到控制前列腺素E2炎癥信號合成通路關(guān)鍵酶類表達(dá)的作用，有效的控制炎癥的發(fā)生及關(guān)節(jié)軟骨的降解。

基因芯片技術(shù)又稱DNA集微芯片、DNA微陣列技術(shù)，其主要原理是分子生物學(xué)中的核酸分子原位雜交技術(shù)，通過技術(shù)手段將DNA片段固定到介質(zhì)上，隨后將熒光標(biāo)記樣本與其雜交，從而對樣本基因進行規(guī)模檢驗，隨著DNA重組技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展，特別是在2005年人類基因組DNA全序列繪制完成，基因芯片技術(shù)已成為基因功能分析研究的最重要技術(shù)之一，診斷疾病是基因芯片最具有價值的應(yīng)用，通過對炎癥狀態(tài)下致病基因表達(dá)譜的研究可為關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制提供新的研究思路和更有效的治療方法?；蛐酒夹g(shù)是以精度、準(zhǔn)度及整體的系統(tǒng)的方法進行研究，宏觀的研究生物基因的表達(dá)和功能。其將核苷酸分子固定于介質(zhì)上，然后與基因芯片上探針列陣雜交，由于列陣中特定位置上的核苷酸序列是已知的，所以利用Affymetrix系統(tǒng)對芯片上每一探針位點熒光信號的強度進行檢測和比較，即可對樣本的信息進行定量定性分析，基因芯片技術(shù)克服了傳統(tǒng)核苷酸雜交技術(shù)復(fù)雜性、自動化程度低及檢測分子數(shù)量少等缺點，可以將克隆到的大規(guī)?；蛱禺愋蕴结樆駾NA片段固定在一塊芯片上，制成表達(dá)譜芯片，對基因表達(dá)個體特異性、組織特異性及病變特異性進行科學(xué)的比較分析，通過研究基因正常表達(dá)與異常擴增、基因與基因之間相互協(xié)同作用關(guān)系、不同的生理病理狀態(tài)下篩選出在疾病各個環(huán)節(jié)及階段起關(guān)鍵性調(diào)控作用的基因，進而將這些關(guān)鍵基因與疾病聯(lián)系起來，對疾病發(fā)病機制提供新的研究思路和更有效的治療方法。基因芯片技術(shù)具有高靈敏度、高通量、高速度、高研究效率、高集成等優(yōu)越性，可以對疾病多因素、基因多樣性進行全面、綜合、系統(tǒng)的分析，因此未來基因芯片技術(shù)在骨科疾病的基礎(chǔ)和臨床研究領(lǐng)域必將得到更廣泛的應(yīng)用。